基因治疗的策略精选(十四篇)
发布时间：2023-10-07 15:39:00
序言：作为思想的载体和知识的探索者，写作是一种独特的艺术，我们为您准备了不同风格的14篇基因治疗的策略，期待它们能激发您的灵感。
篇1
【关键词】 治疗策略；不孕诊断；输卵管因素
从社会现状来看，不孕不育的人群逐年增长，引起了相关专家与学者的高度重视。从各种研究表明，女性不孕和输卵管存在着十分密切的联系，大约占据不孕总数的20%到40%。而输卵管疾病游离不定，可能在近端也可能在远端，还有可能是整个输卵管［1］。因此，必须要根据实况选择合理诊断方法，确切抓住输卵管导致不孕的病因，才能有针对性的制定出治疗策略。1 诊断输卵管因素不孕
如今对于诊断输卵管因素的技术比较多，比如HSG（子宫输卵管碘油造影术）、腹腔镜、输卵管镜等，每种诊断方式有其自身的特征，也有其不足之处。本文针对几个常用方式进行阐述。
1.1 HSG 目前，子宫输卵管碘油造影术被临床上普遍使用，并显示出较多优点，比如不需要麻醉，速度较快，而且还存在潜在治疗作用。采取这种方式一是具有通液之效，同时采用油性造影介质，就能够有效的防止盆腔巨噬细胞吞噬。HSG极易诊断出特征性输卵管的疾患，比如解解性的输卵管炎、输卵管积水等，而且HSG还能够分期诊断输卵管的疾患，观察输卵管的黏膜皱褶图像来判断日后妊娠预后指标［2］。但是HSG也并不是就完美无缺，对于输卵管阻塞造成各个部分之间阻力及痉挛等，采用HSG就不太合适。
1.2 输卵管镜 这种方法是对输卵管疾患进行诊断的内窥镜；做腹腔镜的时候，大都是把输卵管镜直接从伞柄去，以此来观察观察输卵管的壶腹部上黏膜情况。虽然附件炎所造成的粘连和输卵管黏膜损伤之间没有什么必然的联系，可是输卵管的黏膜损伤能够造成不孕［3］。有一些病患者采用了分解腹腔镜粘连，确实能够恢复输卵管解剖结构，也对拾卵有利，但是一旦损伤了输卵管的黏膜就会影响到腹腔镜治疗效果。从临床使用输卵管镜来看，对输卵管黏膜进行正常粘连分解以及输卵管的造口术，它们的累积妊娠率为71%与64%［4］，并且损伤了输卵管黏膜者没有1例出现妊娠。
1.3 输卵管通水 这种又叫输卵管通液，整个过程都要凭借医生手动操作，这样导致主观性较强，误诊率也比较大，几乎达到了50%以上。由此这种误诊率较高，故此不主张使用，在检验输卵管的修复整形效果时比较适合使用。
1.4 超声检查 这种检查方式分为了普通的超声检查与超声下通液，普通检查功能较小，仅仅能够检查出输卵管中是否有积水，但是超声下通液比较容易受到肠道内的气体等各种因素影响，必然造成气体变化［5］，因此临床上误诊率就比较高，而且还会威胁到患者生命，这种方式在临床上使用不多。
对于上面几种诊断方式，目前使用做多的就是经过X线的HSG。这种方法比较清楚观察出子宫腔位置、大小、形状以及输卵管形态，能够有效的看出输卵管、子宫内膜以及盆腔中结核病变的情况。从使用中可以看出，HSG诊断输乱管异常具备较高准确性、较小的风险及低廉费用。2 治疗输卵管因素不孕
治疗输卵管因素不孕，不能过一概而论，而是要依据病患者的类型与程度。选择治疗的方法上也必然要多想到其他因素，比如患者卵巢的储备功能、年龄以及男方因素及患者经济状态，之后综合结合制定治疗方案。总体来看，治疗输卵管因素不孕有如下几种方法。
2.1 宫腔镜下的输卵管插管通液术 这种方法是如今治疗输卵管近端发生阻塞有效方案之一，其主要的治疗优点有如下几个方面［6］：①能够直观、准确的观察出子宫内部的病变；②能够便利的疏通输卵管的近端粘连；③采用这种方案能够准确的诊断出近端输卵管的梗阻，而且极易到达间质部，而宫腔镜就能够弥补这一个缺陷。
2.2 宫腹腔镜联合手术 将腹腔镜与宫腔镜有机联合手术，就能够有效的降低了输卵管阻塞误诊率，而且采用腹腔镜能够修复整形输卵管四周组织扭曲与粘连，顺利的恢复输卵管的拾卵功能与通常度，依据许多文献报道中显示，这二者联合之后附件粘连分离、单纯盆腔粘连之后妊娠率居然达到了50%以上［7］。但是这二者联合手术也存在缺陷，那就是不能对黏膜的皱褶、纤毛受损度进行正确评估，而且花费极高，为患者及家属带来了较大经济压力。
2.3 介入性的输卵管再通术(FTR) FTR在诊断与治疗输卵管的阻塞上具有双重作用。因为这种技术诊断的准确率、再通率高，且操作极其简单，这就成为了面前临床比较常用的治疗技术。FTR能够借助导丝之推力与导丝本身对阻塞输卵管的近端粘连进行分离［8］，能够得到再次观察、造影输卵管的机会，为制定科学治疗策略提供了依据。
2.4 联合中药治疗 目前，比较常用治疗策略就是把输卵管疏通之后，要防止再出现粘连就采用联合中药治疗。上面依据阐述了各种手术疏通输卵管的利弊，为了巩固手术疗效，就要在手术之后使用口服中药进行辅助［9］。10天作为一个疗程，经期时就要停用，连续使用2到3个疗程。
总之，如今诊断输卵管因素不孕方法比较多，最为重要的就是要依据患者具体情况进行个性化治疗，也只有恰当的治疗策略才能取得明显疗效。而且从输卵管因素不孕治疗策略上可以看出，使用手术疏通输卵管之后再联合中药治疗具备较好的效果，必然将被临床多推广。
参考文献
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篇2
治疗原则 控制感染；清洁局部，祛除脓痂，使外耳道干燥。
急性期
全身治疗 可全身应用抗生素控制感染，服用止痛剂。
局部治疗
外耳道肿胀渗液较甚者，可用5%～8%醋酸铝纱条敷塞外耳道，并嘱患者每隔3～4小时自行滴入上述药液，每天更换纱条，有收敛消炎作用，可促使干燥。或用2%～5%硝酸银液涂布。或选用抗生素与类固醇激素合剂、糊剂或霜剂局部应用。
每次换药时彻底清除外耳道脓液及脱落上皮，但禁止在局部作过多过重的机械性摩擦，以免损伤外耳道皮肤。
可加用小功率超短波治疗。机制：①改善局部微循环及淋巴循环，使病变部位的白细胞和抗体增加，炎性反应迅速局限化，病理产物、细菌毒素得以清除；②增强白细胞吞噬能力，抑制自由基产生，激活机体应激反应，增强机体免疫力；③促进炎性反应组织中钙离子增加，钾离子减少，降低组织兴奋性，炎性渗出液减少；④扩张微循环，有利于炎性渗出液的重吸收；⑤使局部环境改变，不利于细菌的生长和繁殖等，而使炎性反应好转。
慢性期
局部治疗
局部应用抗生素(如多黏菌素、新霉素等)与激素类(如强的松龙、地塞米松等)合剂、霜剂、粉剂等换药、涂敷或吹入。
积极治疗感染病灶，如化脓性中耳炎。
因本病导致外耳道狭窄及闭锁而影响耵聍排除及听力者，可在炎症痊愈后行外耳道成形术。
全身治疗 加强全身某些有关疾病的诊治，如贫血、维生素缺乏症、内分泌紊乱、糖尿病。全身辅以维生素A治疗，并注意排除药物过敏因素。
外耳道真菌病
治疗原发病 积极治疗糖尿病、慢性消耗性疾病、肢体癣病等。目前，2型糖尿病的发病率较高，常合并感染，特别是真菌感染，且易反复发作，不易治愈。因此，应建议中老年外耳道真菌病患者进行常规空腹血糖及尿糖检查。在内科系统治疗、控制血糖的同时，局部抗真菌治疗。
局部治疗
消毒生理盐水清洗真菌团块及痂皮，干棉签拭干，局部涂擦达克灵霜或霉克软膏或制霉菌素软膏、溶液或1%两性霉素B软膏等抗真菌药物。如鼓膜有穿孔，注意勿将药物误涂至鼓膜黏膜上。
正确使用抗生素、激素，应认识到局部使用抗生素亦可使局部微生物环境平衡破坏而导致真菌感染。
外耳道皮肤肿胀，渗液时，于清除耵聍残屑及痂皮后，可向外耳道内置入5%醋酸铅溶液的小棉条1根，每天更换1～2次。
保持外耳道皮肤干燥。
戒除挖耳习惯。
全身治疗
重症者全身应用抗真菌药物。
外耳湿疹
防治湿疹的注意事项 少食辛辣刺激性食物，克服挖耳道的不良习惯，保持皮肤干净，忌搔抓，局部忌用肥皂或热水清洗，急性、亚急性期间暂缓预防接种。治疗要及时并要持之以恒。
局部治疗依“湿以湿治、干以干治”的原则。
干燥无渗出液者：涂用1%～2%龙胆紫糊、10%氧化锌软膏、白降汞软膏、抗生素可的松软膏等，保护创面，以便结痂脱落愈合。干痂较多时，应用3%双氧水液清洗。皮肤增厚者可试用3%水杨酸软膏，或用局部浅层X线照射。
渗出液较少者：涂擦2%龙胆紫液，干燥后涂龙胆紫糊或氧化锌糊剂。
渗出液较多者：用3%双氧水液或炉甘石洗剂清洗渗出液及痂皮，再用3%硼酸溶液或5%醋酸铝溶液湿敷。
可给予波长650 nm半导体激光耳腔内照射，输出功率20 mW，10分/次，伴有感染者辅以小功率超短波治疗，5～10次为1个疗程。波长650 nm，输出功率20 mW的半导体激光属于低强度激光照射治疗。近年广泛应用于临床治疗，其生物学作用主要有消炎止痛、加速溃疡和伤口愈合等，有临床报告显示照射具有脱敏，使局部渗出减少、干燥、止痛、止痒、消肿作用，对治疗皮肤湿疹有良好的疗效。耳道内病变位置较为深在，采用耳腔内照射疗法，光线可直接作用于病变部位促进血液循环及淋巴回流，调节局部免疫系统功能，加快病变修复过程，从而达到消炎、消肿、止痛、止痒的目的。耳腔内低强度激光照射为一种安全、有效的治疗方法。超短波疗法电极范围覆盖耳道及整个耳郭，透热作用较深，可增强吞噬细胞的吞噬能力，对于感染性病变具有明显抗炎作用。与半导体激光照射联合应用，起到了表面组织及深部组织治疗互补的作用，较之单一疗法的治疗疗效更为明显。
全身治疗①继发感染时，全身和局部应用抗生素。②服用抗过敏药物，如扑尔敏或克敏能、地塞米松等。③渗液特别多时，静脉注射10%葡萄糖酸钙并补充维生素C。
真菌性中耳炎
全身用药依据药敏结果选择伊曲康唑、盐酸特比萘芬、酮康唑、氟康唑等广谱抗真菌药物口服，对于两性霉素、制菌霉素等不良反应较大的药物要慎用。氟康唑是临床最常用的抗真菌药物，具有抗菌谱广、不良反应小、易吸收和能溶入血脑屏障等优点。
局部清理及用药
局部清理分泌物。首先，在诊断上有助于了解病变是否延及鼓膜或鼓膜有无穿孔，从而决定治疗原则；其次，清理分泌物可有效减少真菌的菌丝及孢子，利于药物吸收。用3%的过氧化氢清洗外耳道分泌物能起到协同治疗的作用。
4%硼酸酒精滴耳液滴耳。酒精本身有抗真菌和收敛作用，而硼酸有抑制真菌作用，但对鼓膜有穿孔的乳突根治术后的患者有明显的致痛、致眩晕作用，故该类患者应避免使用。有湿疹史者应用酒精类制剂亦可刺激其发作，故也应避免使用。
氟康唑注射液外用，无刺激性，可用于鼓膜穿孔者，并可防治鼓室内的真菌感染。国外有文献报道对鼓膜有穿孔的耳真菌病，建议用0.5%的咪康唑溶液，其机制相同。
环吡酮胺软膏、咪康唑软膏、盐酸特比萘芬软膏涂擦鼓膜表面。文献报道，唑类抗真菌药物局部应用具有药性温和、作用强、疗效快、疗程短及反应轻的优点。
篇3
关键词：硝苯地平；不良反应；牙龈增生
目前钙离子通道拮抗剂作为治疗高血压、缓解心绞痛的常用药，以其价格低廉、疗效显著及相对安全，在临床中被广泛应用。其常见的不良反应如：低血压、心动过速、颜面潮红、外周水肿、充血性心衰等，而近年来一些少见不良反应，尤其是该类药物导致牙龈增生的报道相继出现，逐渐引起临床医生的重视[1]。研究发现，在钙离子拮抗剂中，硝苯地平所致牙龈增生最为常见。本文就临床观察到的1例服用硝苯地平后出现牙龈增生的病例进行探讨。
1 资料与方法
1.1一般资料 将我院2015年3月接收1例服用硝苯地平患者出现牙龋增生者作为调查对象，冯某，男，44岁，高血压病10余年，最高血压170/120 mmHg，服用硝苯地平10 mg，1次/ d 3年余，查体：一般情况可，血压110/90 mmHg，心率70次/min，双侧牙龈增生，心肺腹查体阴性，双下肢对称性指凹性水肿。诊断：高血压病3级（极高危）钙离子拮抗剂所致双下肢水肿及牙龈增生，见图1。
图1 牙龈增生
1.2方法 停用硝苯地平，更换降压药为替米沙坦40 mg Qd美托洛尔23.75 mg Qd及短期应用利尿剂。
2 讨论
硝苯地平引起牙龈增生的发病率，国外文献报道为14%～83%，国内有文献报道为20.8%，通常表现为牙龈边缘和牙龈增生，质地坚韧、略有弹性，无痛，一般不出血，但多数患者会伴有牙龈炎症，出现牙龈出血、松软和颜色的改变[2]。
目前，硝苯地平致牙龈增生发病的分子及细胞学机制尚不十分明确，主要与胶原代谢紊乱、激素、炎症与免疫反应等有关，且其发病可能与多种易感因素有关，如遗传因素、个体易感性、用药剂量、疗程、菌斑指数及牙龈炎症、性别、年龄等，其中研究发现，不同人群对硝苯地平的反应不同，发生牙龈增生亦因人而异，即可能分为硝苯地平牙龈敏感型及硝苯地平牙龈耐受型，且用药剂量越大、用药疗程越长，其发生率越高，病变越重。亦有研究发现，口腔卫生条件差、菌斑指数高可加重牙龈炎症，是引起牙龈增生的独立危险因素，一般男性的发病率高于女性，大致为女性的3倍，考虑可能与硝苯地平阻止钙离子内流，使细胞外钙离子堆积，刺激局部雄性激素的代谢，从而促进成纤维细胞的增殖或使胶原酶释放减少有关，另有研究提示其发病率与年龄呈负相关，年龄越小发病率越高，随着年龄增长，其发病率降低[3-6]。
药物性牙龈增生的治疗，首先是停用可能有影响的药物，最好更换为其他类型降压药，大多数患者停药后数月内可自行缓解，对血压控制不好，无法停药的患者，最好采用联合用药，减少单药用药剂量，也能一定程度减少其发病率。对于一些中重度牙龈增生，还可就诊于口腔科，行牙周治疗，如菌斑控制、龈上洁治和龈下刮治、根面平整等，对于严重牙龈增生的患者还可行手术切除，然而该治疗仅为短暂缓解，术后复发率高，尤其是对于未停药、口腔卫生条件差或缺乏口腔护理的患者，因此保持良好的口腔卫生、定期行专业的口腔清洁、控制牙菌斑亦为重要的治疗方案[7-10]。
综上，药物性牙龈增生不仅影响咀嚼功能，同时会影响美观、加重牙龈炎症、产生口腔异味等，也有研究发现牙周疾病的慢性感染过程能够影响心血管系统，最终将形成恶性循环，不利于高血压与冠心病的治疗，故这一问题应该引起临床医生的重视，深入研究其发病机制，寻找更多更有效的治疗方案。
参考文献：
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篇4
关键词：急性心肌梗死；院内介入治疗延迟；原因；护理策略
急性心肌梗死( acute myocardial infarction，AMI) 为因为长时间严重的心肌缺血造成心肌的急性坏死。死亡率极高，达到30%~45%。典型的临床症状为长时间剧烈的胸骨后异常疼痛、急性的循环功能受阻、心律失常、休克、心力衰竭、发热、白细胞含量的升高以及血清心肌酶的活性升高，常常危机到生命安全。随着治疗技术水平的持续上升，AMI的病死率也在有所下降。对于AMI的治疗手法是再灌注心肌治疗，有介入治疗和溶栓治疗，其中介入治疗是首选方式。美国心脏病学会提出，门-首次球囊扩张（door-to-balloon，DTB）时间--患者从进医院到接受介入治疗的时间应当在90 min内。据调查，DTB时间如果延迟30 min，患者的死亡率就会上升7.5%。治疗越及时，存活率就越高。对我院2011年12月~2013年12月中接收的200例急性心肌梗死患者进行回顾性调查。
1资料与方法
1.1一般资料 接受调查的对象为2011年12月~2013年12月来我院进行治疗的200例急性心肌梗死患者，其中男性127例，女性73例，年龄41~83岁，平均年龄为54.3岁，梗死处于前壁的有50例，前间壁45例，广泛前壁48例，下壁57例。接受调查的患者都满足以下AMI诊断法则中的要求（不少于两条）：①有与缺血性胸痛有关的病史；②检查的心电图发生变化；③心肌坏死的血清心肌追踪物含量水平发生动态变化。
1.2方法 通过回顾性调查，统计患者在院内介入治疗时有无延迟以及时间延迟的原因。
1.3统计学方法 使用SPSS15.0统计软件处理。
2结果
接受调查的200例患者中有102例患者发生院内介入治疗的延迟，延迟率高达51%，而在进一步调查当中，发现院外延迟时间、年龄阶段、性别、AMI疑似患者的急救流程繁琐程度都在一定程度上影响了急性心肌梗死院内介入治疗的延迟，见表1。
实验数据表明，随着院外延迟的时间增加，院内介入治疗发生延迟的患者例数越多，年里>65岁的患者发生院外延迟的人数比年龄
3护理策略
为了尽量减少AMI患者的院外延迟时间，护理措施的合适实施是关键。
3.1健康教育 因为心血管疾病是慢性病，所以应该将健康教育从院内扩展到院外，让患者以及他们的家属熟悉此病的发病特点以及典型症状。
3.2急诊患者的类别 我国很多医院接待的急诊患者数量很多，如果不加以分类，区别对待，就会造成急诊室拥堵。应当把急诊患者分成紧急区、诊查区以及等候诊查区，这样让患者按照缓急次序就诊，让病情最危机的AMI患者及时得到治疗。
3.3提升护士分诊的质量 护士在分诊的时候应当进行准确的筛选诊查，这样可以为后续的环节提供保障，为患者的护理提供更优质的服务。
3.4优化AMI疑似患者的急救流程 研究表明，减少院内介入治疗延迟时间的主要方法就是加强各个部门的合作，将AMI患者的急救流程结合起来，让每一个环节都能够及时跟上，减少衔接的时间，要求每一位人员都能够在接到通知的30 min当中到达岗位，并能够及时开展各项任务，以便为患者的治疗做好前期准备。
4结论
在发达国家，急性心肌梗死是心血管疾病死亡的关键病因。本组实验结果表明，急性心肌梗死院内介入治疗的延迟与多方面因素有关，患者的院外延迟时间、年龄阶段、性别、AMI疑似患者的急救流程繁琐程度都影响了AMI患者的及时治疗，应当不断提高医疗水平、改进护理措施、完善急救流程、加强各部门合作、推广新急救流程，以减少延迟时间[1-5]。
参考文献：
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篇5
【关键词】非ST段抬高心肌梗死、预后、因素
【中图分类号】R473.56 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2014）2-0004-01
在临床医学中心肌梗死非为几种类型，其中非ST段抬高心肌梗死，属非ST段抬高于急性冠状动脉综合症，该种心肌梗死的预后效果非常差，患有这类心肌梗死的患者属于高危患者，其死亡率以及再入院治疗率，远远高于ST段心肌梗死的死亡率和入院再治疗率。本文针对非ST段抬高心肌梗死预后的相关因素，以及有效治疗策略进行分析研究，具体结果如下：
1 资料和方法
1.1一般资料：随机选取在2010年4月至2011年4月，在我院进行非ST段抬高心肌梗死治疗的100例患者作为本次研究的对象，其中男性患者64例。女性患者36例，患者的平均年龄为65±13岁，均符合心肌梗死的标准。将6个月预后随访作为观察组，将2年预后随访作为对照组，对两组的临床资料进行回顾分析。
1.2治疗方法：所有患者采用阿司匹林、低分子肝素等药物进行治疗，所有患者没有药物禁忌，加用受体阻滞剂和血管扩张素转换酶抑制剂进行辅助治疗，PCI患者在手术前采用氯吡格雷。
对所有患者的入院治疗情况、病史、体格检查、各项辅助检查以及治疗措施进行详细的记录，并对患者的预后相关因素进行分析。
1.3随访记录：患者的心血管事件：主要终点事件、联合终点事件，将观察组的6个月预后作为近期预后，对照组的2年预后为远期预后。
1.4统计学处理：本次研究中的所有数据采用SPSS15.0统计学软件进行处理，计数资料，采用X2检验，计量资料采用t检验。患者的非ST段抬高心肌梗死预后影响因素，才有Cox生存模型进行分析研究，以HR值和95%CI作为相关标准，以P
2 结果
2.1患者的基本情况：参与6个月随访的患者有80例，其中男性51例，女性29例，平均年龄为68±10岁。使用阿司匹林的患者有69例，有35例患者采用早期保守治疗，45例患者是入院进行各项相关检查并根据病情进行针对性治疗。其中有40例患者是PCI。参与2年随访的患者有57例，男性34例，女性23例，平均年龄为70±11岁。阿司匹林使用者46例，有43例患者采用早期保守治疗，14例患者入院治疗，进行各项相关检查，根据病情进行相关的手术治疗。其中PCI患者有29例。
2.2随访中的心血管事件情况：6个月随访中有20例患者发生心血管事件，主要终点事件（心源性死亡）17例，联合终点事件（非致死性心肌梗死）3例。
3 讨论
心肌梗死是当前临床医学中常见的一种心血管疾病，该类型的疾病根据病因、病情将其非为不同的等级，心肌梗死这种疾病的死亡率非常高，而且预后效果差，其中非ST段抬高心肌梗死的死亡率非常高，在本次研究中观察组死亡率为25.0%，对照组死亡率为40.35%，死亡人数为20例和23例。
根据表三中的数据，可以知道影响非ST段抬高心肌梗死患者预后的主要因素为：年龄、心力衰竭、肾功能不全、阿司匹林、早期PCI。在分析影响非ST段抬高心肌梗死预后的主要危险因素之后，采取有效的治疗方法，制定治疗策略，有效的降低非ST段抬高心肌梗死的死亡率[1]。当前影响非ST段抬高心肌梗死患者预后的危险因素有很多，采用危险因素评估系统进行危险因素评估之后，再采用危险因素等级评估系统，对危险因素进行等级评估。
在本次研究中近期预后和远期预后的死亡率都非常的高，影响非ST段抬高心肌梗死患者预后的主要危险因素为表三中的几项，在这几项影响因素中，年龄是一项独立的非ST段抬高心肌梗死预后危险因素，而阿司匹林的使用是保护因素。在心血管事件中，心力衰竭的重要的危险因素，而且心力衰竭的预测值随着时间的增加而增加，在患者病程延长的过程中，患者肾功能不全的预测值也随呈现增加的趋势[2]。
对患者进行早期PCI策略和保守治疗策略相比，患者的心肌梗死死亡率有所下降。在众多非ST段抬高心肌梗死预后影响因素中，临床治疗主要针对改善患者的肾功能、心脏功能，虽然这种治疗策略还存在一定的不足，但是也取得了一定的成果。
综上所述进行早期治疗可以有效的改善非ST段抬高心肌梗死预后，影响非ST段抬高心肌梗死预后的主要因素为年龄、肾功能不全、心力衰竭、阿司匹林等。
参考文献
篇6
1临床资料
1.1一般资料 并发假性动脉瘤6例患者中男5例，女1例，年龄50～70岁，其中5例体型较胖，均为冠脉内支架术后患者，1例体型适中，为射频消融术后患者，术后均采用"8"字交叉法绷带固定。
1.2临床表现 早期表现为穿刺部位渗血、肿胀，触诊穿刺点附近有搏动性包块，触诊患者有明显痛感，听诊有血管杂音，经血管超声证实。
2假性动脉瘤形成机制
2.1压迫时间过短，压迫部位不准确 压迫时间应根据患者体型及术中肝素使用情况具体而定，我院常规指压止血15～30 min（依术中肝素用量而定，造影检查15 min，支架治疗30 min），观察无出血后采用"8"字交叉法绷带固定。压迫部分应以血管鞘的血管穿刺点为主，而不应压迫皮肤穿刺点，否则极容易形成假性动脉瘤。
2.2术中反复穿刺致血管管壁多个创口不利于术后恢复，假性动脉瘤形成概率增加。
2.3过早活动 经股动脉途径介入治疗患者我院常规要求拔管后严格卧床12 h，过早的肢体活动使假性动脉瘤的发生率大大增加，本报道中射频消融术后形成假性动脉瘤患者即为此类，患者术后4 h自行解除股动脉"8"字交叉法绷带，术后第2 d发现形成假性动脉瘤。
2.4抗凝药物的使用 临床上如急性冠脉综合征患者、冠脉支架术后患者需大量使用抗凝药物，抗凝药物的大量使用，使穿刺点附件不易形成血凝块，从而使穿刺点得不到及时修复，假性动脉瘤的形成概率增加。
2.5高血压患者动脉穿刺后由于血管内压力升高而难以愈合。如合并动脉粥样硬化患者血管中层弹力纤维硬化，穿刺后收缩能力差，也易出现假性动脉 瘤[1]。
3避免措施
3.1选择正确的压迫部位，足够的压迫时间。
3.2选择合适的拔管时机。我院造影检查患者一般术后即刻拔出鞘管，支架患者一般术后4～6 h拔管鞘管，拔出鞘管后方选择使用低分子肝素类抗凝药物，避免过早的拔管及使用抗凝剂。
3.3较强健康宣教，向患者交待术后制动的必要性，避免过早的活动，在拔管后12 h可嘱患者适当的下床活动，术后3～5 d避免剧烈活动，若术后仍需使用大剂量抗凝药物，则剧烈活动时间应进一步延长至停用低分子肝素后3～5 d。
3.4加强术后管理，加强局部观察。密切观察术后有无局部的出血、肿胀，应及时触诊有无疼痛，有无搏动性包块，听诊有无血管杂音，一旦疑诊假性动脉瘤时应及时联系血管超声检查以进一步确诊以便及早处理。
4处理策略
4.1局部压迫法 假性动脉瘤若发现及时，瘤体较小时，可选择局部压迫法。压迫部位应为瘤体破口处，压迫时间>1 h最佳，并且应为持续性压迫，压迫后应及时触诊及听诊，并复查血管超声，若假性动脉瘤消失，仍应该局部包扎3～5 d。压迫时应常规心电血压监护，并准备阿托品、止痛药等，以避免持续压迫过程中可能出现的高迷走反射等。本报道中1例患者经局部压迫1 h后，复查血管超声假性动脉瘤消失。
4.2超声引导下凝血酶注射法 自1991年Fellmeh等[2]首先报道了在超声引导下假性动脉瘤压迫治疗法起，近年来，超声引导下凝血酶注射法已经成为一种很好的治疗假性动脉瘤的方法。
该法的操作流程包括：①通过血管超声明确假性动脉瘤位置、大小、血流情况，并确定假性动脉瘤瘤体与载瘤动脉的关系，从而确定选择进针路径。②在超声监测引导下穿刺瘤体，针尖应尽量远离瘤颈部，当针尖到达瘤腔内后，应由超声操作者使用探头向下适度垂直加压直至漏道或瘤口内无血流通过，在保持正常股动脉的血流通畅的同时术者将凝血酶500～2000 u缓慢注入瘤腔后拔除穿刺针，持续按压瘤口处2～5 min。③解除压迫后如果瘤腔内与瘤口或漏道处彩色血流信号消失，代之以团状高回声为治疗成功。同时监测载瘤动脉是否通畅。④术后患者应继续伸直患肢，局部加压包扎，卧床6 h以防止复发。密切注意患者血压及全身情况，检查患者股动脉及足背动脉的搏动情况。该法具有成功率高、患者耐受性好、操作时间短、复发率极低等优点，但临床上仍应谨慎操作，避免凝血酶进入载瘤动脉等而引起血管闭塞等严重并发症。本报道中5例患者均选择超声引导下凝血酶注射法，其中4例患者成功，1例失败。
4.3 DSA下经对侧股动脉途径瘤体内凝血酶注射法。本报道中采用超声引导下凝血酶注射法失败患者后采用本法成功根治假性动脉瘤。
本法操作流程包括：①患者平卧位，穿刺对侧股动脉。②经对侧股动脉送入微导管或TIG导管，造影明确瘤置、大小、血流情况，确定瘤体与载瘤动脉的关系。③沿导管送入BMW等较软冠脉指引导丝进入瘤体，沿导丝送入微导管至瘤体内，撤出导丝，经导管瘤体内凝血酶注射。约1 min后造影复查。
4.4 DSA下覆膜支架植入，该法临床报道较少，可使用与瘤体腔巨大，经上述方法均未能根治者。
4.5外科修补法 该法应临床创伤较大，随着超声引导下凝血酶注射法的不断开展及技术的不断更新，临床已极少使用。
5讨论
基于上述资料笔者认为医源性假性动脉瘤多于压迫部分不准确，压迫时间过短，过早活动以及大剂量使用抗凝药物等有直接关系，因此临床上应加强介入医师的培养，选择正确的压迫方式，加强患者教育，避免多早的活动，从而使医源性动脉瘤的发生几率下降。一旦临床上发生了假性动脉瘤，临床医生应首先给予局部加压包扎，尽快联系血管超声明确诊断，在压迫治疗无效的情况下尽快的选择经超声引导下瘤体内凝血酶注射，必要时可选择DSA下经对侧股动脉途径瘤体内凝血酶注射法。
参考文献：
篇7
胶质瘤即神经上皮组织肿瘤，是最常见的颅内肿瘤。目前手术、放疗、化疗等常规治疗效果差，而随着基因技术的不断深入研究，如何能利用基因有效治疗胶质瘤成为研究热点， 其基因治疗的分子策略主要包括细胞周期调节、自杀基因疗法、免疫基因疗法、抑癌基因治疗、抗血管生成治疗、PKR途径等，靶向基因治疗主要由临床前概念已过渡到临床试验性治疗的靶点选择，主要包括PI3K／AKT／mTOR和Ras／MAPK／CDK／Rb为代表的受体酪氨酸激酶通路。而最有研究前景的是将尚处于研究阶段的基因治疗与传统化疗、放疗的结合［1］。本文就胶质瘤的基因治疗分子策略及靶向治疗进行综述。
1 胶质瘤基因治疗的分子策略
当前胶质瘤基因治疗的分子策略包括以下几点：细胞周期调节基因及凋亡基因；自杀基因；免疫调节基因；抑癌基因；血管生成抑制基因；PKR途径。以上各策略可相互联系，并相互联合。
1.1 细胞周期调节基因及凋亡基因
P53与E2F1作为2种非常重要的抑癌基因， 维持基因组的稳定， 激活细胞凋亡。两者所不同的是P53基因可调节细胞周期，其变异能明显降低恶性脑胶质瘤对化疗的敏感性， P53基因在脑胶质瘤的高突变率为脑胶质瘤的靶向性基因治疗提供了重要的基础［2］。与P53基因不同的是，E2F1是直接调控细胞周期［3］，其不良反应是它对正常细胞的毒性和潜在的致瘤性。
1.2 自杀基因
自杀基因治疗在胶质瘤的基因治疗中占有极为重要的地位。自杀基因(suicide gene)疗法是指将某些病毒的基因转导入肿瘤细胞，此基因编码的特异性酶类能将细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成细胞毒性产物，以达到杀死肿瘤细胞为目的。不少学者［4］通过研究发现， 只要少量的自杀基因转染的癌细胞与未转染的癌细胞按一定比例混合后共同培养，不仅转染的癌细胞被杀灭，二者相互接触后相邻的未转染的癌细胞也大量死亡，即“旁观者效应”。该效应可使仅部分肿瘤细胞转染了自杀基因的整个肿瘤均受到经自杀基因转化了的抗癌“药”的攻击而全部消退。至于旁观者效应发生的机理， 多数研究表明它与细胞间的缝隙连接和免疫效应细胞在肿瘤病灶中的浸润有关。（1）细胞毒性产物通过细胞间的缝隙连接进入邻近细胞。（2）被破坏的细胞释放毒性物质和凋亡小体进入周围微环境， 并被邻近细胞摄取。（3）自杀基因杀死的细胞释放细胞因子， 进一步吸引免疫细胞进入肿瘤， 介导抗肿瘤免疫反应。（4）导致血管内皮细胞死亡， 引起肿瘤细胞缺血坏死。在肿瘤细胞中旁观者效应的物质基础一缝隙连接数量较正常细胞缺乏， 利用环腺昔酸（cAMP）可以诱导缝隙连接形成或导入缝隙连接的亚单位连接素43（connexin 43）的cDNA， 从而大大加强旁观者效应［5］。临床上，意大利的Colombo等［5］用结合的IL2／HSV．tk基因疗法治疗再生的多形恶性胶质细胞瘤，他们向瘤内注射转录病毒载体引导细胞(PVPC)，然后静脉注射GCV，结果显示，实验组的患者的存活率提高。
1.3 免疫调节基因
免疫调节基因主要是通过基因重组技术来增强机体的抗肿瘤免疫功能达到治疗肿瘤的目的，这主要包括3个方面：（1）肿瘤抗原提呈功能的加强，如从临床患者的血液和手术切除标本中获取自身抗原提呈细胞，在体外经GMCSF等细胞因子作用下扩增，体外表达肿瘤抗原的DNA或mRNA，然后回输入患者体内；（2）细胞因子基因转导肿瘤细胞；如将一基因体外转导脑胶质瘤细胞， 体外培养扩增后接种于病人自身皮下， 可发现肿瘤病灶明显缩小， 颅内胶质瘤明显坏死。（3）B7共刺激分子基因导入肿瘤细胞［7］。Mukhecjee等［8］在靶向T11结构的一种蛋白质(aprotein known as T11 target structure，T11 )注射N乙基·N·亚硝基脲（ ENU)诱导的免疫抑制大鼠后，观察外周和神经系统的改变以及脾，脑浸润淋巴细胞的细胞毒性活性变化，用流式细胞仪测定肿瘤细胞和小神经胶质细胞含量，发现T11TS不仅增加了凋亡细胞的数目，同时降低了分裂细胞数目，而脾和脑浸润细胞的细胞毒性也有显著增加。数据证实了TILTS对实验脑肿瘤的特殊细胞凋亡作用。
1.4 抑癌基因治疗
抑癌基因亦称为抗癌基因，是指正常细胞内存在的能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。目前已分离克隆出20余种抑癌基因，而D53基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，不少研究也证明肿瘤的生成会伴随p53的缺失。Michiue等［8］使用了基因突变的p53蛋白，将羧基末端的多赖氨酸残基用精氨酸取代的产物，转导人胶质瘤细胞，由于存在对Mdm2(鼠双微基因)介导的遍蛋白化耐受性，这种蛋白具有较强的转导调节活性，同时抑制胶质瘤细胞的增殖，表现了其在P53基因治疗方面的应用潜力。
1.5 血管生成抑制基因
固体肿瘤的生长及增殖，需要新生血管提供足够的血运。而胶质瘤自身能产生一些血管生长因子，促进血管内皮细胞的分裂增殖。因此抑制肿瘤血管形成成为冶疗肿瘤的另一策略。早在1971年Fdkamn首先发现肿瘤血管生成因子，并由此提出了对肿瘤血管调控因子及其作用环节进行干预，经抗血管生成途径治疗肿瘤的新方法。它的优势是：（1）抗肿瘤血管生成治疗不是直接攻击肿瘤细胞， 不会产生放疗和化疗所造成的肿瘤细胞遗传性状的不稳定和治疗后耐药性。（2）由于肿瘤部位的血管内皮细胞比肿瘤细胞遗传性状稳定， 而正常血管内皮细胞处于不分裂的状态， 故抗肿瘤血管生成治疗对其影响不大。（3）另外由于内皮细胞本身就浸泡在血液中， 药物到达血管比到达肿瘤要容易得多。这说明抗肿瘤血管生成治疗与传统治疗相比有内在的优势， 已成为一种重要辅助治疗方式。胶质瘤作为一种实体瘤， 抗肿瘤血管生成治疗也具有重要价值。
1.6 PKR途径
活化性双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)是一种生长抑制性蛋白， 通常它能使病毒感染的细胞活化， 并诱导其死亡［10］。
2 靶向性基因治疗研究
临床试验性治疗的靶点选择主要集中在PI3K／AKT／mTOR和Ras／MAPK／CDK／Rb为代表的受体酪氨酸激酶通路，并已开发出一系列靶向小分子药物和单克隆抗体，包括酪氨酸激酶抑制剂、血管生成抑制剂、整合素抑制剂等［11］。
2.1 PβK／AKT／mTOR信号转导通路
EGFR在大多数胶质瘤中过度表达，而在正常脑组织中则低表达。用反义EGFR cDNA转染C6胶质瘤细胞， 观察到内生性的及蛋白水平明显下降， 在荷瘤鼠试验中， 肿瘤的生长明显被抑制［12］。PβK／AKT／mTOR信号转导通路是EGFR下游作用的靶通路之一［13］。PβK／AKT／mTOR信号转导通路靶向治疗方案包括：（1） 以EGFR为抑制靶点，阻断经酪氨酸激酶级联反应介导的信号转导。EGFR小分子抑制剂包括：埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(1apatinib)，可以同时抑制血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)的AEE788；EGFR单克隆抗体：西妥昔单抗(cetuximab)为人／鼠嵌合的EGFR IgG抗体，通过在细胞外与EGFR结合，阻断配体如表皮生长因子(epithelial growth factor，EGF)和转化生长因子一仅(transforming growth factorα ， TGFα)与EGFR结合及经受体酪氨酸激酶介导的信号转导。（2）以m R为抑制靶点：小分子抑制剂包括：雷帕霉素(rapamyein又名西罗莫司，sirolimus)及其衍生物西罗莫司脂化物(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)和Deforolimus(AP23573)等［11］。
罗军.胶质瘤的基因治疗进展 2.2 Ras／MAPK／CDK／Rb信号转导通路
Ras／MAPK／CDK／Rb信号转导通路也是酪氨酸激酶下游作用的靶通路。Ras蛋白是鸟苷酸结合蛋白家族成员，对三磷酸鸟苷(GTP)和二磷酸鸟苷(GDP)具有高度亲和力，并具有同源性GTP酶的活性，有“分子开关”的作用［14］。Ras／MAPK／CDK／Rb信号转导通路靶向治疗方案包括：（1） 以Ras蛋白为靶点，抑制Ras蛋白的法尼基化修饰，阻断Ras蛋白定位于细胞膜内侧。替吡法尼(tipifamib)和洛那法尼(1onafarnib)均是法尼基转移酶抑制剂。（2） 以Raf蛋白为抑制靶点，阻断Ras信号进入MAPK通路。索拉非尼(sorafenib)可以通过抑制Raf及其下游信号通路，直接抑制肿瘤生长；另外，索拉非尼也可抑制VEGFR和血小板源生长因子受体(plateletderived growth factor receptor， PDGFR)，阻断肿瘤新生血管的生成，间接抑制肿瘤生长［11，14］。
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篇8
1 基因在ALI/ARDS发病机制中的地位
ALI/ARDS的发生发展是环境因素和遗传因素综合作用的结果，发病机制复杂。常见导致ALI/ARDS发生的危险因素包括肺内源性因素如肺炎、误吸等，和肺外源性因素如全身性感染、创伤、烧伤、休克等［2］。然而，在接触危险因素的人群中，仅有部分患者发展成为ALI/ARDS，并最终死于ARDS，而且即便是同一危险因素对人体的打击程度相同，不同个体对ALI/ARDS的易感性及预后也不同，推测基因在人类对ALI/ARDS的易感性及预后中扮演了重要的角色［3］。目前发现与ALI/ARDS发生发展相关的基因位点约有17个，它们参与机体免疫炎症反应、氧化应激、凝血、血管功能损伤等过程，并最终影响ALI/ARDS的发生、严重程度及患者的预后［4］。
1.1 基因影响ALI/ARDS的易感性
目前发现有多个基因位点的基因多态性与ALI/ARDS易感性相关，主要包括血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）基因多态性、表面活性蛋白B（surfactant protein-B，SP-B）基因多态性等。ACE基因位于人类第17对染色体长臂3区5带（17q35），其基因型包括3种：插入型纯合子I/I、删除型纯合子D/D和杂合子I/D。D/D基因型患者的ACE表达高于I/I基因型患者，在ARDS患者中D等位基因出现的频率远高于对照人群［5-6］。SP-B是防止肺泡塌陷，维持正常肺功能的重要物质［7］。SP-B是由2号染色体短臂上的单基因编码，其基因组序列具有特征性，不同人群第4个内含子内CA单核苷酸串联重复序列数不同， ALI/ARDS患者重复序列出现的频率比健康对照组高［8］。此外白细胞介素（interleukin，IL）IL-6、IL-10基因多态性也与ALI/ARDS的发生相关［9-10］。提示存在这些基因位点多态性的患者更容易发生ALI/ARDS。
1.2 基因影响ALI/ARDS的严重程度
研究发现IL-8、IL-10及核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）基因多态性与ALI/ARDS的严重程度相关。IL-8基因多态性位点251位A等位基因合成IL-8比T等位基因明显增加，患者病情重，机械通气时间延长［11］。而IL-10基因型为1082GG的患者病情严重程度降低，器官功能障碍的程度亦降低［12］。NF-κB是重要的导致炎症反应的核转录因子，其多态性基因位点的插入缺失突变影响ALI/ARDS患者的严重程度，而与患者预后无关［13］。
1.3 基因影响ALI/ARDS患者的预后
目前与ALI/ARDS患者预后相关的基因包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和ACE2。SOD是一种抗氧化酶，SOD基因位于4号染色体上，其基因多态性来源于编码区编码精氨酸的序列被替换为甘氨酸序列，则细胞内SOD的产生将增加10倍，抗氧化作用加强，患者预后改善［14］。ACE D/D基因型患者不仅与ALI/ARDS易感性相关，也影响患者的预后，含有此类基因型的ALI/ARDS患者预后差［6］。
可见，ALI/ARDS的发生发展与基因异常表达密切相关，提示ALI/ARDS的治疗不应该仅停留在器官功能支持层面上，基因治疗可能是其重要的治疗策略之一。
2 ALI/ARDS基因治疗策略
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因或核苷酸序列通过一定方式导入靶细胞或组织以纠正基因的缺陷或者改变某一特定产物的表达，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。可分为胚胎细胞基因治疗和成体细胞基因治疗［15］。
2.1 ALI/ARDS基因治疗的优势
ALI/ARDS采用基因治疗具有一定的优势［16］：（1）ALI/ARDS是一个急性发作并且病程相对短暂的综合征，仅需短疗程基因治疗，无需反复给药诱发机体的免疫炎症反应；（2）气道上皮和远端肺泡上皮可以通过气道内给药，靶向作用好；（3）心脏泵出的血液需通过肺循环才能到达全身各处器官，因此通过静脉给药对肺微血管内皮细胞也具有较好的靶向作用；（4）基因治疗可针对ALI/ARDS的不同时期发挥治疗作用；（5）基因治疗可特异性地针对ALI/ARDS损伤和修复的某一机制如凝血、氧化应激、上皮间充质转化等发挥靶向治疗作用。
2.2 ALI/ARDS基因治疗的分类
ALI/ARDS基因治疗按基因操作方式分为两类：一类为基因修正和基因置换，即在原位将缺陷基因的异常序列进行精确的修复。通过同源重组技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。另一类为基因增强和基因失活，即不去除异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能；或特异封闭某些基因的翻译或转录，以达到抑制某些异常基因表达［17-18］。此外，通过药物等方式调节细胞或组织器官的外遗传机制如DNA的甲基化、非编码RNA、及组蛋白翻译后修饰（甲基化、乙酰化、磷酸化）亦可达到增高或降低某一特定基因表达的目的［19］。尽管ALI/ARDS的发生可能与患者存在某种易感基因相关，但目前ALI/ARDS的基因治疗主要依赖第二类方法来改变肺组织局部相关产物的表达，从而促进肺损伤的修复。
2.3 ALI/ARDS基因治疗的载体选择
理想的载体不仅能够高效地向靶细胞转染较大外源性基因片段，防止其被核酶降解，还需调节外源基因在细胞内的表达，并且不产生插入突变，不引起免疫炎症反应等不良反应。目前常用载体分为病毒载体和非病毒载体两大类［18］。
2.3.1 病毒载体
腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等是目前常用的病毒载体。腺病毒具有嗜上皮性，在ALI 的治疗过程中可能会导致一过性的肺泡上皮损伤，诱发免疫炎症反应［20］。逆转录病毒仅能转染分裂期细胞，对静止期细胞转染效率低，其应用受到一定限制［17］。腺相关病毒是一种有DNA 缺陷的非致病性细小病毒，具有安全性好、宿主范围广等优点，目前已成为基因治疗研究的热点［21］。
2.3.2 非病毒载体
质粒、脂质体、寡聚核苷酸等非病毒载体在ALI/ARDS中也有较多的应用。它们成本低、安全，但其转染效率较病毒载体低［16］。近年来ALI的细胞治疗尤其是干细胞治疗发展迅速，目前已进入临床实验阶段，以细胞为基因载体的治疗形式亦得到较好的发展，不仅转染效率高，而且减轻免疫炎症反应，与细胞治疗具有协同作用，因而具有广泛的前景［22］。
3 基因治疗在ALI/ARDS治疗中的应用
ALI/ARDS的基因治疗主要通过携带肺保护基因至损伤肺组织，在局部高表达或沉默相关基因，抑制肺部炎症反应，促进肺水清除，改善内皮细胞功能，减轻肺纤维化，阻断ALI/ARDS发生发展的病理生理进程，促进肺损伤修复而达到治疗的目的。
3.1 基因治疗促进肺水肿液清除
通过基因转染促进肺水肿液的清除，从而纠正低氧是ALI/ARDS的重要治疗措施。肺水肿的发生不仅与肺毛细血管内皮-肺泡上皮屏障的破坏相关，还与肺泡上皮细胞肺水清除功能下降有关［23］。研究表明，在肺泡上皮细胞上存在多种离子通道，包括Na+通道（ENaC）、Na+-K+-ATP酶、K+通道等，随着Na+的转运可促进水的清除。不仅如此，角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）也可促进肺水的清除［24］。研究发现通过各种基因转染方法可使ENaC、Na+-K+-ATP酶及KGF等基因高表达，从而增强肺水转运而减轻肺水肿。
病毒载体介导的基因转染可显著促进肺水肿的吸收。目前已证实，在正常大鼠及呼吸机相关的ALI大鼠及高氧诱导的ALI大鼠的治疗中发现，由重组腺病毒介导的基因转染Na+-K+-ATP酶的α2亚基和β1亚基，可明显促进肺水清除［25-26］。Qiao等［23］通过慢病毒向分离的原代肺泡上皮细胞转染Na+-K+-ATP酶的β1亚基，亦可以增加Na+-K+-ATP酶的活性，促进肺水清除。
非病毒载体亦可承载促进肺水清除相关的基因。Stern等［27］的研究发现由脂质体介导的Na+-K+-ATP酶的α亚基和β亚基基因转染可减轻硫脲诱导的小鼠肺水肿的程度，而输注脂质体导致的肺部炎症反应轻微。脂质体还可转载KGF基因减轻油酸诱导ALI小鼠的肺损伤［28］，但较腺病毒转染效率低，效果差［29］。此外，电穿孔法可以直接把裸露的DNA转入小鼠肺组织，不仅可以减轻内毒素诱导小鼠肺水肿，还可减少中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，减轻肺组织的损伤程度［30］。可见，非病毒载体系统可介导基因转染促进肺水清除。
3.2 基因治疗抑制肺部炎症反应
失控的炎症反应是ALI/ARDS发生发展的重要机制之一，调节肺部及全身的炎症反应是ALI/ARDS基因治疗的重要方向。
基因治疗调节ALI/ARDS过度的炎症反应主要是通过携带具有抗炎作用的细胞因子的基因至肺损伤组织局部高表达，从而发挥抗炎的作用。尽管病毒载体可诱导宿主发生免疫炎症反应，但应用腺病毒向ALI小鼠转染IL-10［31］、干扰素蛋白10（IP-10）［32］、IL-12［33］、转化生长因子β1（TGF-β1）［34］等细胞因子基因后，被证实具有较好的抗炎效果，免疫炎症明显减轻，肺损伤也有所修复，并且小鼠病死率也有所下降。
为克服病毒载体诱发并加重宿主的免疫炎症反应，以非病毒载体为转染介质也有长足的发展，传统的以脂质体为载体的基因转染尽管可以一定程度上减轻肺损伤，但由于其转染效率低，抗炎效果不佳。近年来以细胞为载体的基因转染在ALI的治疗中具有重要的作用， McCarter等［35］以及Xu等［36］的研究证实通过向成纤维细胞和间充质干细胞内转染血管生成素1基因，并移植入内毒素诱导的ALI小鼠体内，可明显减轻小鼠肺部的炎症反应及肺损伤程度，而由细胞本身诱导的小鼠肺炎症反应非常轻微。因此，以细胞为载体的基因治疗是ALI/ARDS的治疗未来的发展方向。
3.3 基因治疗改善肺微血管内皮功能
内皮功能受损是ALI/ARDS的重要特点之一，在ALI/ARDS发生过程中具有重要的作用。内皮功能受损主要表现为其分泌功能和屏障功能受损，导致肺部炎症反应和肺水肿发生。因此，调节内皮功能是ALI/ARDS的重要治疗靶点之一。
基因治疗对内皮功能也具有一定的调节作用。它主要是通过转染内皮相关基因至机体内，使其在局部高表达，从而达到治疗的目的。Chicoine 等［37］的研究发现，将载有诱导性一氧化氮合酶（induced nitric-oxide synthase，iNOS）的腺病毒通过气管内注射移植入大鼠肺内，大鼠肺动脉内皮收缩功能减弱，并呈现时间依赖性，大鼠肺动脉高压明显改善。McCarter等［35］把血管生成素-1基因转染入成纤维细胞使其高表达并移植入LPS诱导的ALI大鼠体内，大鼠肺血管内皮分泌iNOS、血红素氧化酶增加，而内皮素-1表达降低，细胞间细胞黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1的表达恢复正常，肺内皮通透性降低，炎症反应减弱，肺损伤减轻。因此，基因治疗可以调节肺血管内皮细胞功能，促进肺损伤修复。
3.4 基因治疗减轻肺纤维化
肺纤维化是ALI/ARDS发生发展的终末阶段，病程难以逆转，致死率高。目前主要的治疗是激素抗炎治疗，但疗效不佳，缺乏有效的治疗方法。近年来基因治疗为其提供了新的途径。研究发现，在博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型中，通过转染TGF-β1的RNA干扰片段，使小鼠TGF-β1基因沉默后小鼠肺纤维化程度明显减轻，肺功能增强［38］。在放射性肺损伤小鼠模型中，通过肌内注射载有可溶性肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）受体1的质粒后发现TNF-α的活性降低，肺纤维化减轻，免疫炎症反应轻微。不仅如此，以细胞为载体的基因治疗在肺纤维化中也得到了应用［39］。Aguilar等［40］在体外通过基因工程技术将KGF基因转染至间充质干细胞，并移植入博来霉素诱导的ALI小鼠体内，小鼠肺组织损伤减轻，后期肺组织内胶原沉积明显减少。此外，组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸的应用，亦可通过外遗传机制调控基因表达，发挥抗纤维化作用［41］。可见，基因治疗可以明显减轻肺纤维化。
4 ALI/ARDS基因治疗面临的挑战
尽管ALI/ARDS基因治疗已取得一定进展，但仍然还面临着许多挑战［16］。 （1）合适的治疗基因靶点的选择 ：目前影响ALI/ARDS的发生发展的因素很多，但选择合适的基因治疗靶点仍不确定；（2）载体的选择与改进：载体是介导基因治疗的重要工具，但在发挥治疗作用的同时也会对机体产生一定的不良反应，如诱导免疫炎症反应和宿主基因的插入突变和失活，因此对载体进行改进有利于提高基因治疗的安全性，也是基因治疗的前提所在；（3）目的基因的表达调控：对导入宿主细胞的目的基因的表达进行调控，有利于调控基因在不同的疾病状态下充分发挥治疗作用，是未来的研究方向；（4）基因治疗的靶向性：尽管ALI/ARDS的基因治疗具有一定的靶向性，但如何使目的基因在宿主基因某一特定部位进行插入整合仍是目前研究的难题。
总之，基因治疗在 ALI/ARDS治疗中的地位越来越受到重视，基因治疗可以通过抑制过度的炎症反应，促进肺水清除，改善内皮功能，减轻肺纤维化，从而减轻ALI /ARDS的严重程度并改善预后，但在治疗的靶向性、安全性等问题上仍然面临许多挑战，是今后重点的研究方向之一。
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篇9
本文主要就IL-12在肿瘤基因治疗方面的应用及前景作一综述。
IL-12的生物学功能
IL-12是一种分子量为70KD糖蛋白，主要由抗原提呈细胞(如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)和B细胞产生，主要分布在激活的CD8+或CD4+T细胞及CD56+NK细胞表面。
IL-12具有多种重要功能：①促进巨噬细胞、NK细胞和T淋巴细胞增殖，诱生多种细胞因子发挥免疫功能。②调节Th1/Th2的应答。Th1细胞主要介导细胞免疫，Th2细胞主要介导体液免疫。其适当的比例有利于机体的免疫应答。③增强NK细胞的细胞毒活性，使NK细胞协同IL-12促进LAK细胞、CTL的形成，增强机体对病原、肿瘤细胞的杀伤清除能力。④最新研究表明，IL-12具有抑制肿瘤血管生成的作用。IL-12在没有免疫作用参与时仍能够抑制肿瘤的生长，推测是抑制肿瘤血管的生成来实现的[1]。
IL-12与肿瘤基因治疗
目前认为恶性肿瘤可能是一种基因疾病，是由正常细胞中某些基因突变而产生的，或是原癌基因突变及抑癌基因突变使细胞出现异常增殖而造成的。基因治疗与其他方法相比具有选择性高，对组织无毒性或毒性小等优点。IL-12具有显著的直接或间接杀灭肿瘤的作用。将IL-12基因导入肿瘤细胞，使其自行分泌细胞因子，使肿瘤组织局部积聚高浓度的IL-12，改变肿瘤局部的免疫微环境，有利于维持持久的免疫反应。经IL-12修饰过的肿瘤细胞，可诱导机体产生较强的免疫应答，机体对其杀伤力明显增强。其具体治疗方法概括起来有两种：体外基因治疗方法和体内基因治疗方法。
体外免疫基因治疗：收获自体或异体的肿瘤细胞或成纤维细胞，体外转染携带IL-12 基因，再重新移植给病人。Tahara[2]以自体纤维母细胞为靶细胞转染IL-12基因，扩增后直接注入体内，或与自体肿瘤细胞混合，经体外照射后作为肿瘤疫苗输回人体。实践证明接受实验的6例黑色素瘤及乳腺癌病人，注射4周后诱导大量CD4+、CD8+细胞浸润，使得IL-12在体内持续分泌维持一定浓度，诱导机体的体液免疫和细胞免疫反应。结果表明，IL-12基因疗法对晚期癌肿也有疗效[3]。
体内免疫基因治疗：将携带IL-12基因的载体直接注射到肿瘤部位，达到抑制肿瘤生长或使肿瘤完全消退、阻止恶性转移、抑制远处肿瘤生长的目的。研究表明，在注射部位附近的肿瘤细胞出现死亡，且可见CD4+、CD8+细胞浸润，TNF-γ在坏死处可见表达。
基因载体：肿瘤基因治疗使用的转染载体主要有质粒载体、病毒载体及非病毒载体。①质粒载体：Tan等将编码IL-12的真核表达质粒直接注射于真皮内，经检测，IL-12于肿瘤局部获得表达，体内NK细胞活性增强10倍，CD3诱导的IFN-γ产量增加3～4倍，肿瘤生长速度明显减慢。②病毒载体：这是基因治疗领域中最常采用的转基因载体，应用多种病毒载体已成功的将IL-12基因带入肿瘤局部并获得表达，显示出良好的抗瘤效应。Nasu等用腺病毒介导IL-12基因治疗前列腺癌，治疗后一天，NK细胞活性延长，7天后CD4+、CD8+细胞浸润开始增加，同时原发前列腺病灶及肺部转移灶明显消退。Tahara将IL-12cDNA以逆转录病毒介导转移鼠肉瘤细胞，结果发现其瘤性消失，同时引起其他野生型肿瘤的消退。目前应用的病毒载体还有很多种，如Senliki Forest病毒载体(SFV)等等。
抑制肿瘤血管生成
近几年抗血管生成基因治疗的研究表明，IL-12、IL-18等细胞因子对肿瘤组织血管的生成具有抑制作用。肿瘤细胞的持续生长需要充足的血液供应，因此抑制血管的生成可以作为肿瘤治疗的靶点，它比内皮细胞作为靶位点有许多优点。近年来抗血管生成基因治疗的研究主要包括：①针对血管形成生长因子及其受体的治疗。②血管生成抑制因子基因治疗，目前研究的血管生成抑制剂即包括IL-12等细胞因子。③针对肿瘤血管内皮细胞的自杀基因治疗等。
基因治疗为肿瘤的生物学治疗提供了一种新的治疗手段，其疗效在体内及体外实验中都得到了充分证实。IL-12抗肿瘤基因治疗除了上述两种方法外，目前多基因联合转导是基因治疗领域的研究热点，也是基因治疗的一种模式。瘤体内联和应用IL-2及IL-12腺病毒转达载体比单独应用更有效。截止2006年1月，全世界已获准的癌症基因治疗临床实验方案已达715个，但只有2个进入三期临床实验阶段，主要是基因治疗也存在着安全性和有效性等问题：①治疗基因能否在肿瘤细胞内持续、高效的表达；②载体系统如病毒载体及逆转录病毒载体转染机体后的安全性问题等等。
所以，关于IL-12的抗肿瘤基因治疗还有很多问题有待解决。总的治疗方案是单一基因治疗向多种不同基因治疗方案过渡。相信随着分子生物学及基因工程技术的不断发展，IL-12等多种细胞因子的抗肿瘤基因治疗会取得令人满意的疗效。
参考文献
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篇10
【关键词】 卵巢癌；基因治疗；综述
卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一， 由于其组织学类型较多， 缺乏有效的早期诊断方法， 且手术和放化疗疗效不佳， 卵巢癌患者的5年生存率仍较低， 成为严重威胁妇科肿瘤患者生命的恶性疾病。在对于卵巢癌治疗方法的探索中， 基因治疗令人瞩目， 在动物实验及一些Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期临床研究中取得了一定疗效， 成为继手术、化疗、放疗之后的一种全新的治疗模式。
1 卵巢癌相关基因
和其他肿瘤一样，卵巢癌的发生是与细胞增殖分化相关的癌基因、抑癌基因多阶段相互作用的结果。目前已发现K-ras、c-myc、c-erb-B2等癌基因和p53、p16等抑癌基因与卵巢癌密切相关，充分认识卵巢癌特异性基因损害的机制有利于制定合理的基因治疗方案。K-ras 编码蛋白p21 ，通过点突变被激活，使其丧失三磷酸鸟苷酸(GPT)激酶活性，致GTP降解成二磷酸鸟苷酸(GDP)的速度减慢，持续的激活靶分子，使细胞持续增殖，从而导致癌的形成［1］。c-myc编码一种转录因子，与细胞周期由G0期向G1期的转变有关，c-myc的扩增和过度表达，使其丧失了转录控制能力， 以致促使细胞大量增殖［2］。c-erb-B2编码一种细胞表面蛋白，结构与表皮生长因子受体(EGFR)相似，在乳腺癌和卵巢癌的发生中起重要作用［3］。还有一些癌基因如int2、fms、mdd、akt2、c-fos、H-ras、raf-1等，在卵巢癌中偶尔扩增，但并不被认为起重要作用。p53基因是目前研究最深入的抑癌基因，30%～80%的卵巢癌患者存在p53突变。p53其功能好比“分子警察”，监视着细胞基因组的完整性，如果DNA受损，则p53基因通过转录调控机制使细胞分裂停滞于G1期， 以便细胞有足够的时间修复损伤，若修复失败，则启动程序化死亡而引发细胞自尽，即细胞凋亡。此外，p53 蛋白的积累可能加速原发肿瘤的转移和扩散。p53缺陷对化疗的耐受有决定意义［4-5］。多肿瘤抑制基因(MTS1)是人们发现的第一个直接参与细胞周期调控的抑癌基因，其编码蛋白为p16，通过与细胞周期素(cyclinD1)竞争性结合细胞周期素依赖激酶(CDK4)，从而使CDK4失活，阻止细胞由G1期进入S期，进而抑制细胞分裂并阻止其向恶性方向发展［6］。
2 卵巢癌基因治疗机制
肿瘤的发生是多因素、多步骤过程，包括了癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活而导致细胞增殖增强与凋亡受到抑制。卵巢癌的发生亦是与细胞增殖分化相关的癌基因、抑癌基因多阶段相互作用的结果，如:erbB、c-myc、K-ras等癌基因的突变与扩增和(或)抑癌基因RB、p53、p16 等的功能丧失均可导致肿瘤发生。通过基因治疗即把正常基因或重组治疗基因经分子生物学技术手段转入异常细胞的DNA系统中，以抑制致病基因表达或修复缺陷基因表达，起到治疗作用［7］。目前，卵巢癌基因治疗方案主要有:自杀基因治疗、基因表达封闭、多药耐药基因治疗和联合基因治疗。
3 卵巢癌基因治疗载体
实现肿瘤基因治疗的关键是要使用高效、安全的基因导入系统。常用病毒和非病毒系统作为基因导入载体。病毒载体能有效地将原位基因导入肿瘤细胞中，这种带有抗癌基因并特异性杀伤肿瘤细胞的病毒被称之为基因-病毒系统。体内外实验表明，腺病毒介导的卵巢癌转基因治疗能有效抑制卵巢癌细胞生长，并延长卵巢癌小鼠模型生存期［8］。非病毒的质粒内插入具有治疗作用的目的基因及所有顺式调控元件如启动子、增强子及沉默子序列和转录处理信号时，就可用于哺乳细胞的转染，当含有一个病毒复制子时，即可指导质粒在靶细胞核中扩增。质粒与病毒载体相比，虽然基因转染率较低，但不会整合入宿主的基因组而产生致病的野生型病毒。近年来以质粒为载体的基因治疗多使用阳离子脂质体为导入介质，目前阳离子脂质体介导的转基因治疗卵巢癌已进入Ⅰ期临床试验［9］。基因载体系统增强抗癌能力的方法有:①在载体上携带多种治疗基因联合作用，以提高病毒对癌细胞的杀伤力;②修饰载体的外壳蛋白使其特定地与肿瘤细胞结合，并增加其对肿瘤细胞的亲和力;③调控载体的肿瘤特异性启动子或增强子，使治疗基因的表达限于肿瘤细胞，避免对非肿瘤细胞造成伤害。理想的靶向性基因转移载体一直是学者们努力的方向。
基因重组技术可利用肿瘤细胞表面一些特异性高表达的受体或抗原，编码与这些受体或抗原特异性结合的基因片段插入到病毒外壳糖蛋白(Env)基因中，使该载体表面出现一种嵌合Env，从而提高病毒对宿主细胞的亲和性，同时降低它与非靶细胞结合的机会［10］。结构蛋白VP22是Ⅰ型单纯疱疹病毒的主要壳膜蛋白，有细胞间扩散作用的特性，可改善基因治疗效率。VP22和胸苷激酶(tk)融合基因及丙氧鸟苷自杀基因系统对肿瘤细胞具有特异靶向性生长抑制作用，利用卵巢癌细胞表面高表达的Ⅰ型跨膜粘蛋白MUC1，将抗MUC1单链抗体ScFv与VP22 载体的包膜结构VSVG的转膜区和胞质区部分构建到一起，以此膜结构包装的目的基因VP222tk能靶向性的结合并杀伤表达MUC1的卵巢癌肿瘤细胞［11~13］。
近年来研究发现，柯萨奇腺病毒受体(CAR)在病毒细胞的入口中起决定作用，在腺病毒载体的临床实验中，CAR表达水平上调有利于腺病毒基因系统导入卵巢癌细胞系，并增强表达p53腺病毒的细胞毒作用，该作用是由于CAR是细胞黏附蛋白，并可分裂细胞与细胞间的连接，因而使腺病毒基因系统更易导入癌细胞［14-15］。此外，在卵巢癌细胞系和原发卵巢癌中表达的CD40是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，在CD40腺病毒靶向系统中可增加靶基因融合蛋白的数量并有剂量依赖性，CD40 介导的载体病毒转染可被用于不依赖CAR途径的基因转换，这就解决了CAR表达水平低的肿瘤细胞基因转染问题［16］。
4 卵巢癌的基因治疗策略
4.1 自杀基因治疗 自杀基因治疗卵巢癌是近年来研究的热点，其中有组织特异性启动子OSP-1（ovarian-specific promoter-1）参与调控，使自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶（erpes simplex virus thymidine kinase，HSV-tk）与前体药物无环鸟苷（ganciclovir，GCV）结合，HSV-tk/GCV通过转染肿瘤细胞使tk基因在癌变的组织或细胞异地表达，从而使无毒的前体药物GCV转化为有细胞毒性的磷酸化的GCV产物，抑制DNA酶活性，阻止DNA合成，进而杀灭肿瘤细胞。HSV-tk 抗肿瘤效应的另一原理是“旁观者效应(bystander effect）”，即转导细胞对非转导细胞的细胞毒作用。已证实腺病毒介导的HSV-tk基因治疗裸鼠间皮瘤、结直肠癌、卵巢癌实验中可使肿瘤消退［17-18］。体外研究结果显示：与间皮细胞结合的HSV-tk对GCV杀灭肿瘤细胞的作用非常敏感，能增强GCV 的“旁观者效应”，使肿瘤生长受到明显抑制［19］。
4.2 基因表达封闭——RNA干扰（RNAi） RNAi在哺乳类动物细胞中是利用同源双链小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）诱导特异性基因表达抑制，其主要发生于转录后基因水平，所以又称为转录后基因沉默（post transcription gene silencing，PTGS）。双链RNA（double strand RNA，dsRNA）首先被切割为siRNA，siRNA 与一些蛋白形成RNA 引导的沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC），介导基因表达沉默。由于RNAi的特异性、高效性、方便性，已成为研究基因功能、肿瘤基因治疗的新方法。Wani等［20］利用RNAi技术抑制肝细胞刺激因子-1在卵巢癌透明细胞瘤中的表达，使其mRNA水平分别降低45%，并诱导其细胞凋亡增加。Bignotti等［21］将脂肪酸合酶（fattyacid synthase，FAS）的siRNA转染到培养的卵巢癌SKOV3细胞中，导致FAS基因的表达沉默，与对照组相比，HER2的表达下降60%并诱导细胞凋亡。以上研究结果表明，利用RNAi技术对于治疗和预防卵巢癌具有一定的作用并显示出巨大的发展潜力。
4.3 多药耐药基因治疗 化疗是治疗卵巢癌的常用和有效的手段，但肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉抗药性（multidrug resistance，MDR），是造成化疗失败的主要原因。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）在卵巢癌细胞中过表达，与卵巢癌化疗的多药耐药的发生密切相关，而P-gp被MDR基因所编码。研究者利用反义寡脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ODNs）抑制MDR基因而降低P-gp的转录，其中双链ODNs比单链ODNs作用更有效，可阻遏卵巢癌细胞A2780中P-gp的表达，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［5，9］。Bcl-2基因在卵巢癌细胞中高表达并参与化学药物耐药的发生，E1A 基因联合反义寡核苷酸Bcl-2（antisense oligonucleotide Bcl-2，Bcl-2-ASO）治疗卵巢癌可明显促进癌细胞凋亡（凋亡能力的提高主要是由于细胞色素C的释放以及Bcl-2-ASO激活caspase-9所致），抑制癌细胞增殖，减少耐药性的发生［15］。
4.4 联合基因治疗 卵巢癌的发生是多种致病因素相互作用的结果，针对一种因素的治疗往往不能使肿瘤的生长受到明显抑制，而各种自杀基因系统发挥作用的机制并不相同。比如CD和HSV-tk融合蛋白的表达可使抑制肿瘤的效应明显增高。自杀基因发挥旁观者效应主要取决于机体自身的免疫力即免疫反应的强弱，自杀基因系统可分别与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF）、白细胞介素2（IL-2）、干扰素（IFN）等免疫细胞因子有效结合，一方面对肿瘤细胞有直接杀伤作用，另一方面又可使机体对肿瘤的免疫应答提高，发挥其旁观者效应从而使肿瘤生长受到抑制。针对卵巢癌的RNAi技术可同时抑制肿瘤发病的几个关键基因，从而抑制肿瘤生长［22］。
5 卵巢癌基因治疗的临床应用
由于实验室的研究结果令人鼓舞，卵巢癌基因治疗的临床试验正在进行中，目前已完成了利用不同的转染途径将目的基因应用于人卵巢癌的分子治疗。Haralambieva等［23］在其Ⅰ期临床试验中，利用逆转录病毒载体转染BRCA1基因对复发性晚期卵巢癌患者进行临床治疗，观察到载体稳定表达，抗体反应很小，肿瘤消退。但在其Ⅱ期临床试验中，在对未广泛转移的早期卵巢癌患者，应用同样的方法，由于载体表达不稳定和很快产生抗体反应，不得不终止治疗。他们认为免疫系统状态在基因治疗的有效性上起到关键作用。Menczer等［24］利用未改进的腺病毒载体介导转染HSV-tk基因于复发性卵巢癌患者，29%的病例有一过性可控制的与载体有关的发热。Psyrri等［25］利用腺病毒载体将野生型p53基因转入复发性卵巢癌患者的腹腔，患者有可接受的毒性，与顺铂结合治疗，可使血CA125下降和症状改善。
6 卵巢癌基因治疗的展望
基因治疗为卵巢癌的治疗展现了一个极有希望的前景，无论是在动物试验或前临床试验中，卵巢癌基因治疗的方法、思路正在不断创新与完善。但基因治疗本身还存在着许多问题，如：载体转导的效率低、稳定性不佳及不能有效定位于靶组织或靶器官等。另外，多数肿瘤的形成都不是单一的基因突变，那么以单一突变基因为靶向的治疗很难控制整个肿瘤，所以需要加强多基因为靶向的实验研究。学者们正针对卵巢癌基因治疗中存在的一些问题如载体的改良、目的基因的靶向性等进行更加深入的研究， 相信随着分子生物学理论和技术的发展， 人类将开辟卵巢癌基因治疗的新纪元，卵巢癌的基因治疗必将能够成为一种常规的、有效的治疗手段。
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篇11
[关键词] 腺相关病毒；阿尔茨海默病；开放阅读框；神经生长因子
[中图分类号] R749.1+6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）31-15-02
The Application of Adeno-associated Virus Load in Alzheimer’s Disease
GAO Huifang
Dehui People’s Hospital in Jilin Province, Dehui 130300, China
[Abstract] To explore the application of adeno-associated virus load in Alzheimer’s disease. Adeno-associated virus load is the one which is often used in gene therapy, because it owns the unique biological characteristics of integration on special spot, causing no other side effects. According to the results of a series of experiments and study, it can express itself forever and has little bad immune reaction. Its pre-clinic experimental result is ideal. Its advance of reorganization brings hope to future gene therapy and it lays a solid foundation for future clinic treatment.
[Key words] Adeno-associated virus; Alzheimer’s disease; Open reading frame; Nerve growth factor
腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体是目前基因治疗中最常用的病毒载体。由于其具有定点整合、无致病性、可长期表达、免疫反应性小等独特的生物学特性，日益受到人们的重视。现针对腺相关病毒的生物学特性和其在阿尔茨海默病中的应用作一综述。
1 AAV的生物学特性
AAV属于微小病毒科、依赖病毒属，直径约25nm，无包膜，呈二十面体对称结构。当有辅助病毒如腺病毒等存在时，AAV才能够进行复制和装配，因而得名腺相关病毒。目前AAV已经有12种人源性血清型（AAV1～AAV12）和110多种非人灵长类动物源性血清型[1]被发现，其中，AAV2是目前研究最为透彻、应用最为广泛的血清型。
AAV2基因组[2]是长4.7kb的线性单链DNA，包含两个开放阅读框（open reading frames，ORFs）。左侧ORF编码复制调节基因rep，可产生4种Rep蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep78和Rep68是P5启动子的转录产物，分别通过非拼接和拼接的形式产生，是AAV各生命周期中重要的反式作用因子。在辅助病毒存在时，它们可以促进AAV基因的表达，反之则产生抑制作用，为AAV的复制所必需。由P19启动子转录、分别通过非拼接和拼接形式分别得到Rep52和Rep40蛋白，能够促进单链病毒DNA自聚，以利于其顺利为外壳蛋白所包被。右侧ORF编码cap基因，通过P40启动子转录产物的不同拼接形式，产生3种不同的病毒衣壳蛋白―VP1、VP2和VP3。在AAV2中，三种蛋白以1110的比例构成病毒衣壳。
ORFs两侧为长145bp的反向末端重复序列（inverted terminal repeats，ITRs）。ITRs是AAV的顺式作用元件，其外侧的125个核苷酸呈回文序列，可以通过碱基配对自身折叠形成一个“T”型的发卡结构（T-shaped hairpin structure）。ITRs中含有AAV DNA的复制起始位点（origin），其发卡结构中折叠部分可作为自身引物促进其复制过程中第二链的合成。在ITRs序列中含有Rep蛋白结合元件（Rep binding elements，RBEs）和末端解离位点（terminal resolution site，TRS），可与复制调节蛋白Rep结合，在从AAV复制起始到形成双链的整个过程中发挥关键作用。除复制外，ITRs在AAV基因组的包装、转录、非复制允许条件下的负性调控和点特异性整合等过程中也都是必不可少的。
AAV2可以通过与宿主细胞表面受体硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan）结合进入细胞。此外，还有一些共受体可以增强细胞对AAV2的内摄作用。目前已知AAV2的共受体[3，4]有αVβ5整联蛋白（αVβ5 integrins）、纤维母细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1）、肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor）、αvβ1整联蛋白（αvβ1 integrin）和层粘连蛋白受体（laminin receptor）等。AAV感染宿主细胞后存在两种生活周期：溶解期（lytic stage）和溶源期（lysogenic stage）。在辅助病毒（腺病毒或单纯疱疹病毒）存在时，AAV进入溶解期，其基因组复制、表达并产生具有感染性的病毒颗粒。而当辅助病毒缺如时，AAV的复制和表达受到抑制，以潜伏感染的形式整合到19号染色体（q13.4）的长4.0kb的AAVS1区域中。定点整合能力是AAV独有的生物学特性，其机制与AAV基因组中的ITRs、Rep78或Rep68以及一段长138bp的整合效率元件[5]（integration efficiency element，IEE）有关。潜伏感染的野生型AAV在组织培养中不具有致病性。据统计，在人群中70%～80%的个体感染过AAV，但到目前为止临床上还没有因AAV感染而引起不良后果的报道。这是AAV的另一个独特的生物学特性。
2 AAV与阿尔茨海默病
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种发生于老年期或老年前期，以进行性认知障碍和行为损害为主的神经系统退行性疾病，是老年期痴呆的最常见类型。患者尸检显示脑组织萎缩，特别是海马和前脑基底部神经元缺失，组织病理学上的典型改变为β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积形成神经炎性斑（neuritic plaques，NPs）和神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）。其发病机制尚未完全明了。
AD在临床上以脑循环改善剂（如尼莫地平、氟桂利嗪等）、亲智能药（如甲磺双氢麦角胺、胞磷胆碱等）、神经递质相关药物（如多奈哌齐、美金刚、吡拉西坦等）及对症治疗为主，疗效有限。AD的基因治疗目前多致力于保护胆碱能神经元和减少Aβ的沉积等方面。
2.1 神经生长因子策略
AD认知和记忆功能障碍的主要解剖基础是海马组织结构的萎缩，功能基础主要是胆碱能神经兴奋传递障碍和中枢神经系统内乙酰胆碱受体变性、神经元数目减少等。目前采用的比较特异性的治疗策略是保护中枢胆碱能神经功能。
经大量研究证实，在AD动物模型中，给予神经生长因子（nerve growth factor，NGF）能够保护胆碱能神经元、改善疾病所致的行为异常。与传统的胆碱能保护药胆碱酯酶抑制剂（cholinesterase inhibitors，ChEIs）相比，NGF能够：①更有效地保护基底前脑胆碱能神经元（basal forebrain cholinergic neurons，BFCNs）；②增加残余BFCNs活力；③产生更多的乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）而不具有剂量依赖性外周毒性；④能够保护和修复Ach传递的天然时空模式[6]。
对NGF的研究已有数十年的历史，其在体外及动物体内所取得的实验结果令人振奋，给AD等神经系统变性疾病的治疗带来了希望。人们试图将神经营养因子治疗策略在动物模型中取得的成功转化到临床应用上。目前，NGF已经用于糖尿病性周围神经病、HIV相关神经病和AD的临床试验中。然而，每一项临床试验的结果都令人失望，或未见疗效，或副作用明显。NGF在体内半衰期短，不能通过血脑屏障，因此，只有持续将药物直接作用于靶点才能达到治疗目的。因此，若要成功应用NGF治疗AD，必须满足以下两个条件：①能够有效作用于靶细胞并能够在靶作用点长期、稳定表达；②表达范围不能超过靶细胞以外的区域。Kathie M等提出利用AAV2携带人神经生长因子（CERE-110，AAV2-NGF），通过立体定向外科手术的给药方法作用于Meynert基底核（nucleus basalis of Meynert，NBM）[7]。结果表明，CERE-110可以准确在脑靶作用区域中表达；通过调整给药剂量，可以控制NGF的表达范围；NGF的表达在给药后的3、6、9和12个月时都可以在受试动物中观察到。目前，应用CERE-110治疗轻、中度AD的Ⅰ期临床试验业已开展。
2.2 疫苗治疗策略
老年斑是AD的特征性病理表现，其主要组成成分为β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）。Aβ沉积与淀粉样蛋白前体（amyloid precursor protein，APP）的变异及其转化过程发生改变有关。减少Aβ沉积亦成为目前基因治疗的主要靶点之一。
AN-1792，由Aβ42肽和QS-21佐剂构成的世界上第一个Aβ疫苗，于1999年12月进入临床试验阶段。然而，在2002年1月，由于6%的受试者出现无菌性脑膜脑炎（aseptic meningoencephalitis），以致该试验在Ⅱa期时被提前中止。尸检发现，接种者脑中的Aβ明显减少，并可检测到浸润的CD4+ T淋巴细胞。这些结果证实，疫苗启动了小胶质细胞对Aβ的清除，但也同时激活了Aβ反应性自身免疫T细胞，并使其侵入中枢神经系统，介导了脑部的炎症反应。令人欣慰的是，获得抗Aβ抗体的受试者，与未获得者比较，其认知功能减退的速度明显降低，日常生活质量显著提高。因此，Aβ疫苗依然是一种充满希望的AD治疗策略，但必须要解决其所涉及的安全性问题。为此，科研人员开发了各种各样的技术，力求在增加特异性抗体产生的同时，尽可能地减少自身免疫性T细胞毒性作用。
腺相关病毒因为其本身的低免疫源性和无致病性为Aβ疫苗的应用开拓了新的思路。Zhang等利用腺相关病毒作为载体，尝试不同的给药途径，在AD转基因小鼠体内表达CB-Aβ42（霍乱毒素B亚基和Aβ42融合蛋白）。结果证明，这种AAV-CB-Aβ42诱导产生了可长期表达的高水平的Aβ特异性抗体，提高了小鼠的记忆和认知能力，减少了脑内Aβ的积聚和相关的星形胶质细胞增生。这些实验结果证实了AAV介导Aβ疫苗的安全性和有效性，相信会给AD的疫苗治疗带来新的生机。
2.3 其他
重组腺相关病毒载体还广泛用于其他各种AD基因治疗中。如其在细胞内抗体（intracellular antibodies）、脑啡肽酶（neprilysin，NEP）、载脂蛋白E基因（ApoE）等的应用中，都取得了较为理想的前临床实验结果，这为其将来进入临床治疗打下了良好的基础。
3 展望
基因治疗已经成为目前医学研究的热点。有效的基因治疗需要解决以下3个问题：①在分子水平上阐明疾病发生的机制；②找出治疗疾病的相关基因；③应用适合的载体通过合理的方法将目的基因导入靶细胞。目前用于基因治疗的载体分为两类：非病毒载体和病毒载体。前者包括裸DNA（purified DNA）、基因枪（shotgun）和脂质体-DNA复合物（lipid-DNA complexes）等。这些非病毒载体各具特色，但其基因传递和表达效率较低，不能满足人们的需要。目前主要的病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒和腺相关病毒等。每一种病毒载体都各具有其优点和缺点。其中，腺相关病毒由于具有宿主范围广、能够定点整合入人类染色体、无致病性、可以稳定和长期表达、免疫源性小等特点，日益受到科学工作者的青睐。目前，rAAV已经成功地转导了肌肉、肝、脑、视网膜和肺等组织。有关rAAV载体介导的各种临床试验也正在开展中。此外，对AAV载体本身的改造亦没有停止，一系列的努力克服了AAV自身的局限性，极大地拓宽了它的应用范围。
基因工程的研究已经有数十年的历史，但是，到目前为止，还没有哪一种载体在基因治疗中是尽善尽美的，尽管重组腺相关病毒载体在多种疾病的病因学和动物实验中都取得了可喜的进展，但是以腺相关病毒作为载体的临床试验，其结果都不能令人满意。腺相关病毒载体还存在许多问题（例如免疫反应等）限制了它更为广泛的应用。关于基因治疗，我们还有很长的路要走。重组腺相关病毒载体的进展为基因治疗的明天带来了希望，还需要广大科研工作者不断地进行更为深入的研究。
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篇12
【中图分类号】 R734.2【文献标识码】 B【文章编号】 1007-8517(2009)24-0100-01
肺癌是常见的恶性肿瘤之一,目前治疗是以手术、化疗、放疗为主,联合生物治疗、中医中药治疗等的综合治疗模式,但随着肿瘤分子生物学、免疫学以及分子生物学技术的发展,肺癌生物治疗不断被赋予新的内容,治疗方法逐渐扩展到基因治疗、免疫治疗以及近年来兴起的分子靶向治疗[1],为肺癌治疗开辟了更为广阔的前景。本文就肺癌生物治疗的现状及研究进展综述如下。
1 肺癌生物治疗现状
生物治疗的原理是通过为肿瘤患者补充具有杀死、抑制肿瘤能力的免疫细胞和能力,调节患者自身免疫功能,达到控制和清除肿瘤细胞的目的,主要包括细胞因子技术、基因治疗技术、肿瘤疫苗技术、免疫活性细胞继承性输注技术、单克隆抗体及其耦联物技术等[2],彼此之间并没有明确的界限,它们的出现标志着肿瘤生物治疗体系的基本形成,虽然途径与方法各异,但目的都是通过最大限度的利用人体自身所具有的抗肿瘤能力来治疗恶性肿瘤。生物治疗有自己独特的优点,毒副反应较低.仅在高剂量时有低血压、发热皮疹、抗原抗体反应等,发生率较低[3],临床上治疗肺癌应用最多的为细胞因子,免疫调节剂、基因治疗和分子靶向治疗药物也已应用于临床,过继免疫细胞中淋巴活化杀伤细胞(LAK)已见报告,为今后生物治疗的发展研究提供了丰富的内容。
2 肺癌生物治疗研究进展
2.1 分子靶向治疗肿瘤分子靶向治疗是利用分子靶向药物特异性,以肿瘤组织或肿瘤细胞中所具有的特异性分子为靶点,阻断该靶点的生物学功能,或选择性从分子水平来逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为,从而达到抑制肿瘤生长甚至肿瘤消退的目的[4]。其中以表皮生长因子受体(EGFR)和肿瘤血管生成作为靶点的药物占60%,以表皮生长因子受体作为靶点的治疗药物包括吉非替尼、埃罗替尼、西妥昔单抗等,以肿瘤血管生成作为靶点的治疗药物包括贝伐单抗、ZD647、内皮抑素、基质金属蛋白酶等,其它靶向治疗药物如基质金属蛋白激酶(MMPs)抑制剂、血管生成因子抑制剂、法尼基转化酶抑制剂(FTIs)、环氧化酶抑制剂、组氨酸脱乙酰化酶抑制剂等分子靶向性药物正在进行临床前或临床试验研究中[5]。
2.2 细胞因子治疗 常用于肺癌的细胞因子有干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、红细胞生成素(EPO)和集落刺激因子(CSF)等。细胞因子的应用是目前最成熟的生物治疗方法,尤其是IFN和IL,目前已经在肺癌治疗中应用非常成熟,CSF、TNF、EPO等也逐渐被广泛应用,在肿瘤的治疗中起到了重要作用。IFN是最早发现具有抗癌效应的细胞因子,早在1980年第一次用于小细胞肺癌(SCLC)的实验中就显示出了良好的前景。IL一24是近来发现的一种新白介素,利用腺病毒转染的方法发现其可以抑制肺癌细胞的增殖并可以增强肺癌细胞对放疗的敏感性。CSF及EPO的应用对于克服骨髓抑制、预防传统放化疗所产生的白细胞下降及红细胞减少无疑起到了保驾护航的作用,为提高放化疗药物的使用剂量从而达到更好的治疗效果起到了关键作用[6]。
2.3 免疫治疗 主要包括肿瘤疫苗、过继性免疫治疗及补充细胞因子,其中发展最快的是肿瘤疫苗。目前应用的肺癌疫苗有肿瘤细胞疫苗、胚胎抗原疫苗、病毒疫苗、癌基因产物疫苗、人工合成多肽疫苗、抗独特型疫苗和树突状细胞疫苗等,树突状细胞疫苗能形成强有力的特异性细胞免疫应答,有效地清除血源性播散的肺癌细胞,发展最为瞩目[7],Ueda等应用CEA652体外冲击致敏树突细胞,治疗CEA阳性的肺腺癌患者,发现治疗后患者病情稳定,血清中CEA水平明显降低。受到重视的还有第3代疫苗:核酸疫苗,包括DNA疫苗和RNA疫苗, DNA疫苗在体内可持续高表达相应抗原,被树突细胞摄取并致敏后,激发高效的细胞和体液免疫反应,是最有潜力的肿瘤疫苗发展方向。
2.4 基因治疗
2.4.1p53基因治疗 在基因治疗研究中,以腺病毒转染抑癌基因p53的表达研究较为成功。国外对重组腺病毒介导的p53基因治疗NSCLC的临床研究已基本完成,结果显示腺病毒p53注射液在NSCLC中有抗瘤活性。一项研究中,对12例气道阻塞且无法手术的肺癌患者瘤内注射重组腺病毒p53注射液106―1011pfu,28天重复一次,其中6例患者症状得到缓解。然而也有研究者将重组腺病毒p53注射液联合化疗治疗NSClC,发现两组疗效和生存期无显著差异。
2.4.2 杀伤基因将具有杀伤作用的基因片段导入细胞复制的DNA序列中,从而打断细胞基因的连续性,抑制基因的过量表达和肿瘤细胞的增殖。自杀基因和凋亡基因通过引发肿瘤细胞的凋亡而起到杀伤肿瘤细胞的作用。TK基因-GCV系统是最有希望在临床上用于肿瘤基因治疗的方法之一,在肺癌基因治疗中具有显著作用。
2.4.3 RNAi技术 在针对肿瘤的基因治疗策略中,RNAi技术以其自身的诸多优势,在不影响正常基因功能的前提下,可以针对在细胞癌变过程中发挥重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因、血管生成因子及其受体以及部分关键酶等,抑制突变基因表达或基因的过量表达。如Zhang等用HER-1 siRNA抑制了肺癌细胞A549的EGFR的表达,使肺癌细胞比对照组细胞数减少了85%,EGFR蛋白表达下降了70%以上,对顺铂的敏感性增加了4倍。
3 展望
作为一种新的治疗模式,生物治疗目前还存在很多问题,如各种治疗药物的有效性、安全性还有待于进一步评价,是否有必要采用特异性检测手段筛选分子靶向药物的适应人群来实现个体化用药,及建立这类药物与手术、放化疗之间的最佳联合方案还需不断摸索。但我们深信在不久的将来,随着对肿瘤生物学特性和行为了解的不断加深、分子药物研究的不断发展,将会出现一批新型的低毒、高效靶向治疗药物,为肺癌乃至其他所有肿瘤患者带来福音。
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篇13
【关键词】超声微泡；双自杀基因慢病毒载体；基因治疗
【中图分类号】R341 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0013-02
目前，基因治疗已成为一种全新的肿瘤治疗模式，其中自杀基因治疗是一种颇具临床应用潜力的治疗策略， 但是由于治疗的靶向性成为关系到治疗安全性的瓶颈问题。近年来研究表明[1-5]，超声微泡造影剂有望成为一种新型的体内靶向给药的载体系统。本研究旨在构建超声微泡包裹的特异性双自杀基因慢病毒载体，为临床实时可视状态进行超声定位控释和载质粒微泡基因治疗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的构建与包装
1.1.1目的基因的扩增与TA克隆
提取正常人外周血gDNA，并通过PCR方法扩增出KDRP、CD、TK基因；回收
PCR产物并分别将其链接到pMD18-T载体上，构成重组T质粒；抽提质粒，并对各重组T质粒的酶切鉴定及测序；
1.1.2 慢病毒载体构建与包装鉴定
将经测序证实的T-KDRP、T-CD、T-TK三种质粒上的KDRP、CD、TK元件通过特定的限制性内切酶酶切后，依次连接到经相应酶酶切的pLenti6-EGFP载体上，经脂质体法转染至293T细胞，24h后通过荧光显微镜即可见GFP荧光表达，72h后收集上清，0.45um滤器过滤，25000rpm离心90min，沉淀溶于Hanks溶液，-80℃贮存备用。将梯度稀释的病毒液，加入293T细胞中，72h后置于荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计数发荧光细胞数目，根据病毒用量和稀释度计算滴度。按公式计算病毒滴度：
病毒滴度=GFP细胞阳性数×病毒上清稀释倍数/0. 4m1（pfu/ml）。
1.2 载药粒微泡的制备于鉴定
1.2.1载药粒微泡的制备
声诺维sonovue为磷脂包裹的六氟化硫（SF6），按使用说明注入生理盐水5 ml震荡形成微泡混悬液。取50ul微泡悬液于1.5mlEP管内，再滴加入100MOI病毒载量的病毒上清液，轻轻混匀后室温孵育20 min。
1.2.2载药粒微泡的鉴定方法。
采用Malvern激光测量仪检测载药微泡的粒径大小，光学显微镜观察其外观，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定载药微泡的包封率和载药量。
（1）粒径大小比较
载质粒微泡为白色混悬液，PBS（Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲生理盐水）冲洗，静置后分三层，上层、中间层为微泡，下层为PBS液。去除上层及下层液，取中层液，测定其粒径大小，镜下比较观察载药微泡与空白微泡外观。
（2）包封率的测定
将制备好的含有慢病毒载体的微泡溶液中加入5%乙醇1 mL混匀，6℃，16000 rpm高速离心20min，去上层微泡，取下层液体，加5%乙醇0.5 mL稀释冲洗，再加入适量乙醚，漩涡振摇，6000 rpm离心15 min，取乙醚层，50℃水浴挥干后，加0.5 mL甲醇溶解作为样液，进样量10μL。采用RP-HPLC测定双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的包封率，按下式计算包封率：
包封率（%）=[（投入药量―游离药量）/投入药量]×100%
（3）载药量的测定
以下式计算载药量：
载药量%=（Wt～Wi）/Wc×100%
其中Wt为脂质微泡溶液中药物总含量，Wi为游离药物量，Wc为磷脂用量。
（4）稳定性测定
4℃冰箱贮存，对短期内的载药微泡溶液的质量进行监测。
取少量载药微泡混悬液分别于1d、2d、5d、8d、10 d经光学显微镜（×400）进行观察其形态变化。第10 d的取该样品由Malvern粒径测量仪检测粒径。4℃冰箱贮存10 d后，RP-HPLC测定载药微泡溶液的包封率。
2 结果
2.1 病毒滴度检测结果：
经荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计数发荧光细胞数目，根据病毒用量和稀释度，获得病毒滴度为（3.5×1012pfu/L）的双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK。
2.2 载药微泡质量鉴定：
2.2.1包裹有pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的声诺维微泡与空白声诺维微泡粒径的对比观察：
载质粒微泡呈乳白色混悬液，用磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate buffered saline PBS）冲洗，静置后分三层，上层、中间层为微泡，下层为PBS液。
镜下比较观察载质粒微泡（图A）与空白微泡（图B）的形态，其形态相近，为近似的圆形微泡。其粒径范围92%在2～5μm之间，平均粒径约2.90μm（图A），粒径大小均相似。
2.2.2 包封率和载药量测定结果
采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定载药微泡的包封率和载药量，
得到结果：
包封率为90.6±3.1%。载药量为29.2±0.9%。
2.2.3 稳定性测定：
4℃冰箱贮存10 d后，可见仍为乳白色混悬液，光镜下观察，微泡粒径大小未见明显变化，微泡形态好，大小均匀，相互之间无明显聚集现象，分层情况基本同前，样品经光镜下观察及Malvern测量仪检测发现，与制备初始相比，平均粒径大小约3.08μm），未见明显变化；RP-HPLC测得包封率：86.1±2.8%，没有出现明显药物渗漏。
3 讨论
基因治疗已成为一种全新的肿瘤治疗模式，其中自杀基因治疗是近年来新兴的肿瘤基因治疗的研究热点。自杀基因疗法是利用基因工程技术将自杀基因转入肿瘤细胞进行表达，注入体内的无毒或低毒的前药在表达的特异性酶作用下转化成毒性产物，该产物可作为DNA合成的核苷替代物掺入到DNA中，干扰细胞DNA的合成，从而引起肿瘤细胞的死亡[6]。
本研究所采用的克隆方法并不是将PCR产物直接与表达载体相连接，而是先将PCR产物TA克隆，构建成重组T质粒后再将目的基因与表达载体酶切连接，主要是考虑到：PCR产物直接进表达载体成功率不高；而先进T载体，再酶切连接表达载体，可减少碱基错配，提高成功率。目前己发现的自杀基因体系已有十多种，本实验选择胞嚓陡脱氨基酶基因（CD）和单纯疤疹病毒胸普激酶基因 （HsV-TK简称TK）来构建双自杀基因质粒，是因为研究表明[7]，二者作用机制具有很强的互补性，将其连接在一起，构成融合基因，使两个自杀基因体系协同作用，能显著增强对肿瘤细胞的杀伤作用。同时选用肿瘤特异性启动子KDRP，突破对肿瘤细胞类型的依赖性，扩大肿瘤基因治疗谱。运用增强型GFP绿色荧光蛋白作为报告基因，可直观的检测目的基因的检测和计算病毒滴度。而慢病毒载体最大的特点是可以感染分裂期及非分裂期细胞，容纳外源性目的基因的片段大，可以在体内长期地表达，不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，可在更多范围的宿主细胞内生成高滴度的病毒，己成为当前基因治疗中载体研究的热点。
超声微泡造影剂声诺维可作为一种新型基因载体。在一定剂量超声波的辐照下，利用微泡在超声介导下的空化效应介导目的基因的靶向释放和导入。国内外许多学者通过体内外实验证实空化效应是超声介导基因转染的主要机制，微泡造影剂作为外源性空化核被引入体内后大大增加了单位体积内空化核的数量，降低超声波的空化闭值，增强空化效应，从而提高基因转染效率[3-4]，尤其在抗肿瘤治疗、溶栓治疗等方面具有潜在的重要应用价值。经静脉注入载药微泡后，用超声辐照特定部位，含气体的超声造影剂在超声波作用下会不断地产生非对称性收缩和膨胀，当声能达到一定强度时，微泡破裂药物被释放到超声所辐照的局部组织中。在这一过程中，微泡作为空化核增强空化效应，依靠能量辐射作用，使微泡破坏后释放的药物能够进入血管壁甚至组织间隙，从而发挥定位靶向治疗作用[2]。
而载药微泡的外观、粒径大小、包封率、载药量等是衡量载药脂质微泡质量的最重要指标。我们制作的载双自杀基因慢病毒载体微泡乳化良好，大小均匀，粒径范围92%在2-5μm，与空白微泡相似。微泡内药物的包封率为90.6±3.1%，载药量为29.2±0.9%，均达到较理想的水平。此外稳定性也是衡量载药脂质微泡特性的主要指标之一，它能反映脂质微泡溶液包封率随时间变化的情况。脂质微泡作为药物载体稳定性是指被包裹药物在脂质微泡中的滞留性。经由本实验证实，我们制作的载药微泡同时也具有较高的稳定性。
本研究联合了双自杀基因的杀伤效应、KDR启动子的肿瘤特异性、慢病毒载体的高载性和超声微泡靶向的可控释性等多种技术优点，制备出了较为理想的载有靶向基因药物的微泡，期望为进一步临床实施可视状态下的肿瘤的基因治疗提供一种更加安全、高效的策略。
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作者简介：
郝轶，硕士，主治医师，新疆医科大学附属肿瘤医院，830011。
基金项目：
新疆维吾尔自治区自然科学基金（编号：2011211B19）Correspondence to：HAO Yi（郝轶）
篇14
【摘要】 [目的]检测自杀基因系统HSV1tk/GCV对鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应。[方法]将B16/tk(tk+)细胞和未经修饰的B16(tk-)细胞按tk+细胞占总细胞数的0%、10%、20%、40%、80%比例分别进行混合，各组细胞于96孔板中培养，加入丙氧鸟苷(GCV)至157μmol/L，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同tk+比例的HSV1tk/GCV系统在体外对肿瘤细胞的杀伤率。各组混合细胞分别接种于小鼠腋下，以GCV注射液按100 mg·kg-1·d-1进行治疗，检测瘤块体积、质量(湿重)，测定抑瘤效应。[结果]tk+比例10%以上，HSV1tk/GCV系统对黑色素瘤B16细胞均有明显杀伤效应，但旁杀伤作用不明显;从移植瘤体积看，20%以上tk/GCV治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(P
【关键词】 黑色素瘤;自杀基因系原/治疗应用;基因疗法;细胞培养
恶性黑色素瘤是皮肤肿瘤中恶性程度最高的肿瘤，其发病率在世界范围内位居所有恶性肿瘤中第7位。致死率高的主要原因在于黑素瘤细胞本身抗凋亡能力强及生长微环境血供丰富。肿瘤的基因治疗，特别是肿瘤自杀基因治疗已经成为最具应用前景的、崭新的肿瘤综合治疗措施之一。目前已在临床病人及实验动物上广泛应用于肝癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、脑瘤、黑色素瘤等恶性肿瘤的治疗，并已观察到较好的效果[1-2]。该方法的一个显著特点是存在旁观者效应(bystander effect)， 即加入前体药物后，不仅导入了自杀基因的细胞被杀死，邻近未导入的细胞也可被杀死[3-6]，但也存在许多不足，限制其广泛应用的关键之一是不能把目的基因导入每一个待治疗的受体细胞，体内转染率通常只有10%左右。因而增强旁杀伤效应目前已成为提高自杀基因疗效的重要策略。本实验观察了不同比例B16/tk与B16对体外和体内抑瘤效应的影响，为探讨中医药增强自杀基因疗法疗效的可能性进行前期准备工作。现报道如下。
1材料与方法
11药物及配制丙氧鸟苷(ganciclovir，GCV)为丽珠集团湖北科益药业有限公司产品，注射用粉针剂(批号：080801 082)，015 g/支，临用前采用注射用生理盐水15 mL溶解，浓度为10g/L。
12实验仪器与试剂细胞培养用RPMI1640粉和胰蛋白酶为Gibco公司产品，青、链霉素合剂为杭州吉诺生物医药技术有限公司出品，新生牛血清为奥地利PAA公司产品，四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均为美国Sigama公司产品，IX71F22FL/PH型荧光倒置显微镜及图像采集系统(日本Olympus)，BioRad680型全自动酶标仪(日本BioRad)等。
13细胞株小鼠黑色素瘤细胞株B16购自中山大学动物中心细胞库。病毒包装细胞PT67购自美国Clontech公司，本课题组已构建重组PT67/tk，并将其产生的重组pLXSN/tk的逆转录病毒转染到B16细胞内并筛选到稳定整合株，记为B16/tk [7]。
14细胞培养用完全培养基(含RPMI1640培养基、体积分数10%新生牛血清、100 U/mL青霉素、01 mg/mL链霉素)接种在培养瓶中，置体积分数5%CO2、37℃培养至融合率80%～90%时传代进行实验，接种细胞浓度为1×105/mL。
15动物C57BL/6J小鼠，l8～22 g，雄性，健康，SPF级，购自中山大学实验动物中心，合格证号：SQAK(粤)2004-0011。
16tk/GCV对小鼠黑色素瘤细胞株B16的体外杀伤效应B16和B16/tk(tk+)按tk+细胞占总细胞数的0、10%、20%、40%、80%、100%混合，以2×104个/mL的密度将细胞接种于96孔板，体积为每孔100 μL，培养24 h后每孔加入终浓度为157 μmol/L的丙氧鸟苷(GCV)，加入RPMI1640培养基至每孔总体积为200 μL。每组设6个复孔，培养箱中培养72 h，MTT法检测：加药培养后，吸弃每孔上清，每孔加入无血清RPMI1640细胞培养液90μL和MTT10 μL(500mg/L)，置于培养箱内培养4 h后，吸弃全部上清培养液，加入DMSO 150μL，震荡10 min，然后用酶标仪在490 nm波长下测定每孔吸光值(D)。
17小鼠移植性黑色素瘤的造模及治疗C57BL/6J雄性小鼠54只，随机分为正常对照组、模型组、0%tk/GCV组、20%tk/GCV组、40%tk/GCV组、80%tk/GCV组6组，每组9只。将B16/tk和野生型B16按tk+细胞占总细胞数的0、20%、40%、80%比例混合，接种前镜下观察黑色素瘤细胞形态。将混合后的小鼠黑色素瘤细胞制备成2×109个/L的细胞悬液，台盼蓝活细胞计数>90%。常规酒精消毒C57BL/6J小鼠右腋下皮肤，按01 mL/只悬液(含2×105 个肿瘤细胞)分别接种小鼠右前肢腋下组织内造模，记为模型组、0%tk/GCV组、20%tk/GCV组、40%tk/GCV组、80%tk/GCV组。正常对照组右前肢腋下注射生理盐水01 mL/只。正常对照组和模型组第8～15天以蒸馏水腹腔注射02 mL·d-1·只-1，其他各组第8～15天腹腔注射GCV，给药剂量为100 mg·kg-1·d-1。
18观察项目
181一般状况观察小鼠活动情况、毛发、营养、肿瘤生长及死亡等情况。
182肿瘤体积在肿瘤出现后每天用游标卡尺测定肿块的长径a(cm)及与之垂直的短径b(cm)，计算肿瘤体积[8]V(cm3)=05×a×b2，根据测量的肿瘤体积绘制肿瘤生长体积曲线图。
183肿瘤质量实验结束后处死动物，仰面固定，用眼科剪分离剥取肿瘤，万分之一电子天平称质量(湿重)，记录结果。计算抑瘤率[9] ：P抑瘤(%)=(m模型组-m治疗组)/ m模型组×100%
19统计学方法采用SPSS 100统计软件包，组间比较用LSD法。肿瘤质量数据的处理是先进行数据对数转换，随后进行方差分析。
2结果
21GCV体外杀伤效应铺板后倒置显微镜下观察细胞，可见细胞均匀透亮，胞膜完整，胞体呈圆形，悬浮于培养液中;24 h后，细胞呈现贴壁状态，细胞形态为扁平的多角形，胞质均匀，胞膜完整，各组间无明显差异;48 h和72 h后，Bl6/tk的给药孔中均见细胞死亡，表现为细胞变圆，大片漂浮，胞膜不完整，并且碎裂成小粒状，tk+细胞比例越高，死亡细胞数越多。野生型B16细胞对照组及给药孔均呈现明显的细胞增殖，GCV对其无明显作用(图1)。MTT检测显示，B16对照组和0%tk/GCV组抑制率差异无显著性意义(P>005)。而B16tk/GCV各组随着tk比例的增加细胞密度逐渐降低、抑制率明显增加，但旁杀伤效应不明显(表 1)。表 1不同tk+细胞比例对tk/GCV系统杀伤B16细胞的影响
22各组小鼠一般状况、成瘤时间及成瘤率正常对照组小鼠体形正常，运动快速有力，反应灵敏，被毛浓密有光泽，黑色，紧贴身体而不粗乱蓬松。其他组小鼠随着肿瘤的增大，逐渐表现为活动迟缓，被毛无光泽，肿瘤越大表现越突出。模型组、0%tk/GCV组、20%tk/GCV组、40%tk/GCV组接种第11天后陆续可触及皮下肿瘤，成瘤率100% ，80%tk/GCV组接种第12天后陆续可触及皮下肿瘤，成瘤率111%。(注：计算成瘤率时在模型组出现首例肿瘤前死亡动物不作为总数计算)
23各组接种后不同时间肿瘤体积及肿瘤生长体积曲线随着治疗的进行，20%以上tk/GCV治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(P
统计方法：t检验;①P
图2肿瘤生长体积曲线
Figure 2Tumor growth curre of different groups
24各组肿瘤质量(湿重)实验结束后处死动物，剥离肿瘤，称质量。表2结果表明药物治疗的各组肿瘤质量均较模型组轻，但只有80%tk/GCV组有明显抑瘤作用(P
25肿瘤的肉眼观察模型组和B16/GCV组肿瘤大小不一，体积较大，形状不规则，呈黑褐色，多数肿瘤切开时见肿瘤组织坏死;其他各不同比例B16tk组体积较小，形状较规则，肿瘤外周有假包膜形成，以80%tk/GCV组最明显(图 3)。
3讨论
基因治疗就是将外源性基因导入到正常或病变细胞中，利用其转录或翻译产物发挥治疗作用的一种方法，是分子生物学技术在医学中的一项重要应用。目前较成熟的肿瘤基因治疗方案有：免疫基因治疗、抑癌基因治疗、自杀基因治疗、肿瘤多药耐药基因治疗、抑制血管生成的基因治疗等[10]，其中自杀基因疗法较受关注。HSVtk/GCV治疗系统为其中最常用、最重要的自杀基因系统之一。该系统的作用机制是：将HSVtk(单纯疱疹病毒胸苷激酶)基因转入肿瘤细胞后让其表达tk(胸苷激酶)，然后加入低毒的核苷类似物GCV，GCV被tk催化生成为丙氧鸟苷一磷酸(GCVMP)，随后在细胞里原有的鸟苷酸激酶和核苷二磷酸激酶作用下生成丙氧鸟苷三磷酸(GCVTP)。GCVTP可竞争性地参与细胞DNA的生物合成，导致DNA损伤，抑制细胞分裂，引起细胞死亡。tk/GCV自杀基因系统已经被美国FDA批准进入Ⅲ期临床试验研究，被应用于脑肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤的临床试验阶段。拥有我国自主知识产权的基于tk/GCV系统方案的基因治疗制剂也于2004年7月经国家食品药品监督管理局批准进行了Ⅰ期临床试验，并即将开展Ⅱ期临床试验[11-12]。
黑色素瘤是起源于神经外胚叶的恶性肿瘤。大多发生在皮肤，如躯干、头颈、手背、下肢等部位，也可发生于皮肤以外的黏膜、脑膜、虹膜、脉络膜、腮腺、呼吸道、胃肠道、阴道、心脏等。黑色素瘤常规治疗方法有：手术治疗、化疗、放疗、免疫治疗等。由于黑色素瘤的早期转移和对放疗、化疗不敏感，以及免疫治疗的毒副作用等因素，传统治疗方法未能获得满意的疗效[13]。因而，黑色素瘤成为基因治疗研究的主要对象之一[14-16]。
本研究体外实验结果显示，已构建的tk/GCV系统能有效杀伤小鼠黑色素瘤细胞，20% tk+细胞比例可使抑制率达到 211%，但旁杀伤效应不明显。体内抑瘤实验显示，随着tk+细胞比例的增加，抑瘤率也随之升高，80% tk+/GCV组和其他各组比较差异均有显著性意义(P
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