商业模式的保护精选(五篇)

序言：作为思想的载体和知识的探索者，写作是一种独特的艺术，我们为您准备了不同风格的5篇商业模式的保护，期待它们能激发您的灵感。

篇1

[关键词] 会展 知识产权 商业模式

知识经济与互联网时代到来至今，形成了多种崭新的业态，会展商业模式创新也成为会展业不断发展必不可少的原发动力。要使这种创新源源流长、要让创造者积极所为，必须对该类创新实行制度性保护，对侵权人形成威慑性约束，对侵占他人权利行为实施惩罚性制裁。但目前，我国对会展商业模式保护的关注和研究尚未有效展开。

一、会展业知识产权保护历程

作为现代服务业范畴的会展行业,其知识产权保护最早可以追溯到1873年的“维也纳国际发明展”。当时,展会举办国奥地利制定了一项特殊法律,向展会展出的各国发明、商标和外观设计提供特殊的临时保护。会展行业知识产权保护由此起步。

历史的脚步走到了21世纪门槛边,全球会展行业早已织就了较为完整的知识产权保护网,商标、技术发明、外观设计、新型应用等一应俱全。但也就在此时,随着计算机和网络技术的广泛应用,实践中出现了除已经被完善保护的传统知识产权形态外的样式繁多的会展商业模式。就是这类集人类智慧、借助现代技术手段实现的创新活动,却因其迟到,被拒在了已有的知识产权保护网之外。

为了保证并促进对各国经济繁荣起到积极推动作用的会展业的发展,面对出现的问题,各国相关学界、政府部门和企业,逐步投入到了会展行业商业模式保护的研究和实践之中,领头的自然还是发达工业国。

二、商业模式及会展商业模式保护现状

1.发达国家的研究与实践

(1)美国专利商标局(USPTO)于2000年3月公布了一项应对商业模式专利的行动计划。该计划的内容主要包括:修订商业模式发明专利的审查标准，扩大对美国“专利分类705”申请案件的检索范围，加强专利审查员的培训，以及保证对商业模式专利申请进行适格性、新颖性和非显而易见性的实质审查。USPTO还在2000年7月公布的商业模式专利白皮书中对商业模式专利的演变、“专利分类705”，以及专利审查员的培训方式做出了详细的说明，旨在进一步规范该类专利审查的标准。此外，USPTO还创建了“技术中心2100”，专门审理“专利分类705”类目中的申请。统计数字表明，第705类专利在1999年之后急剧上升，从1995年申请数的170件猛增到2000年的7800件，2001年达到1万件。经过几年的实践，在“阳光下一切人类的发明创造均可获得专利”的呼声中，商业模式在美国获得专利保护已不是问题，美国专利商标局和法学家们现在研究并更为关注的是，如何使该类专利审查制度稳定并规范。

(2)欧盟专利局曾一度将商业模式排除在专利保护之外。根据《欧洲专利公约》第52条规定，科学原理、数学方法、实施心理活动游戏或商业模式的技术、规则、方案,以及计算机程序、信息的表达是不可授予专利的。但随着美国率先认可了商业模式可以成为专利法保护的客体后，为了在国际知识产权的竞争中取得优势地位，欧洲专利局的态度也开始倾向于承认商业模式的可专利性。2001年11月欧洲专利局了新的专利审查指南，确认了其在计算机软件和商业模式上的扩大保护政策。根据该审查指南，商业模式的可专利性已不容置疑。欧洲专利局在处理一项商业模式专利的申请中，更加注重对其创造性和技术特征的判断，而非仅仅审查其是否属于商业模式本身。在经过了长期的、多方的辩论之后，欧洲的态度已由对商业模式专利的强烈反对转变为不再抵制，即商业模式可以通过“技术包装”而获得专利法的保护。

(3)日本在对待商业模式专利的问题上采取了实用主义的策略和主张。2000年日本特许厅修订了《专利审查指南》，增加了与商业模式有关的发明创造的实施例，对利用网络或计算机的商业模式不再被视为抽象的概念，可以在日本获得专利法的保护。此后，日本又于2002年修改了本国的《发明专利法》；2003年，日本知识产权战略本部又公布了“知识产权战略推进计划”，充分表明了其积极提升本国知识产权竞争力的态度和决心。

2.国内研究与实践

(1)会展实践方面。针对国内会展商业模式的表现形式,已有不少公开报道。如上海世博会标志特许经营的运营模式;第二届中国(深圳)国际科学生活博览会结合全国性的活动和互联网及媒体的资源，确立了三大平台互动的全新展会运营模式;慧聪网水工业产品采购交易会和慧聪网泵阀产品采购交易会将传统贸易展览会和电子商务有机结合,形成“采购交易会＋电子商务平台”――线上线下互动模式等等。此外,国内还有对诸如基于会展会后服务的商业模式、商业会展市场推广的整合模式、市场化运作展会模式等都进行过报道。

(2)司法实践方面。2000年3月，上海卓尚信息有限公司告e龙网信息技术北京有限公司“网上商业模式侵权案”，出现了号称“中国网上商业模式保护第一案”；2007年5月，北京首都在线网络技术有限公司提出“网络桌面媒体”商业模式的专利申请，出现了我国“商业模式保护”专利申请第一案。

(3)法规方面。2004年10月1日国家知识产权局于新颁布了《商业模式相关发明专利申请的审查规则(试行)》;2006年5月30日,国家版权局、信产部颁发的《互联网著作权行政保护办法》开始实行等。

另据国家知识产权局新闻发言人2007年介绍：从2006年开始，中国《专利法》进行第三次修改，送审稿当年年底已正式提交国务院审议。又据国家保护知识产权工作组办公室主任、商务部副部长在2007年介绍：“2007年政府部门在加强对知识产权的司法保护方面一个显著的特点就是，要进一步根据《专利法》修改情况研究制定涉及侵犯专利权认定标准的司法解释；通过对知识产权行政案件司法审查的范围、标准、程序、裁判方式等问题的调研，推动出台司法解释。”

3.结论

(1)对“商业模式”作为知识产权的一种类型进行保护已形成共识。从上述内容可以看到,以美、欧、日为代表的发达工业国对商业模式保护在本世纪初就从研究、立法、实施等各层面全面展开,我国也已在2004年颁布了相应的审查规则。

(2)保护方式多采用专利保护形式。知识产权保护方式通常为著作权保护、商标保护、专利法保护和反不正当竞争等。归纳国内外已有的实践和研究,对商业模式的保护主要采用专利保护法。

(3)会展行业商业模式保护尚未涉及。一方面,会展行业知识产权保护目前仍局限于商标、技术发明、外观设计、新型应用等传统领域,而对其商业模式保护国外也刚刚起步,国内未曾涉足。另一方面,现有商业模式保护的成功案例,无论国内还是国外,都集中在电子商务、网络游戏、金融和商业行业,在会展行业基本没有实践和研究。

三、会展商业模式保护的重要性与紧迫性

1.会展业的健康发展对上海的经济发展具有重要意义

上海市委书记在近期的市委常委会上指出：“上海转变经济发展方式迫在眉睫，现代服务业的发展决定上海未来。”上海近几年致力于发展的和发展最快的是现代服务业，2006年GDP比重已经超过全市的50%，而会展业则是其中重要的一块，其增长速度在最近的10年每年超过20%，而且还在紧锣密鼓筹办世博会。

2.会展业的健康发展需要更加完善的知识产权保护

上海把现代服务业中的会展业作为重点发展点，而且作为2010年世博会的举办地，上海自觉不自觉、愿意不愿意都已成为世界会展领域的瞩目地，也必将成为会展行业知识产权保护的中心舞台。面对行业内出现的知识产权保护的新内容、新问题，如何提升国内会展行业知识产权保护水平？是否需要对会展商业模式实行保护？怎样有效实现对会展商业模式的保护？如何与国际接轨、是模仿还是创新？世博会期间站在世界会展舞台中心的上海，在知识产权保护方面应该以什么样的形象出现？怎样体现希望的形象？……这些都是值得研究，而且是即待研究。

3.会展商业模式保护的完善，有利于整体创新环境优化

总书记2008年6月23日在“两院院士大会”上指出：“转变发展方式、实现经济社会又好又快发展，迫切需要我们加紧建设创新型国家”；“建设创新型国家，这是国家发展战略的核心”；“自主创新能力是国家竞争力的核心”。

会展商业模式创新和保护是知识产权保护的新领域，会展业又是现代服务业的重要组成部分，是上海经济转型发展的方向之一。开展会展商业模式保护研究，不但有利于知识产权保护水平的提高，也有利于创新城市乃至创新型国家的建设。

参考文献：

[1]龚维刚:上海会展业发展报告2007.上海人民出版社,2007.10

[2]过聚荣:2006年～6007中国会展经济发展报告.社会科学文献出版社，2007.4

[3]刘大可:中会展业:理论、现状与政策.中国商务出版社，2004.8

[4]贾丹明:“欧洲商业方法专利分析”[J].中国发明与专利,2007(5)

[5]余 翔 邱洪华:“美国银行业商业方法专利发展态势及其启示”[J].电子知识产权,2007（11）

[6]高山行 胡海平:“试论商业方法的专利保护”[J].情报杂志,2004（08）

[7]宋蓓蓓:“商业方法的可专利性问题探析”[J].审计与理财,2007（3）

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关键词：互联网保险 商业模式 发展策略

课题：

1、高职保险专业群人才培养模式研究 湖南省十二五教育规划课题，编号：XJK012CZJ104。

2、湖南经济发展中的保险支撑机制与实证研究――以服务“四化两型”建设为视角 编号：14C0004。

互联网保险是普惠保险（Inclusive insurance）中的一种新兴业态，在2013年，众安在线宣布网络险企，互联网保险成为名极一时的财经新闻。根据相关研究资料显示，在2012～2013年，经营互联网保险业务的主体从32家上升到63家；互联网保险保费收入从35.12亿元上升到301.02亿元；投保客户数从823.51万人增长到5632.54万人。从上述数据不难看出，互联网保险在我国的增长态势可喜。互联网对我国保险业带来深远而又持久的影响，发展互联网保险成为我国保险行业发展的必然选择。为了能够规范互联网保险市场和保护消费者的合法权益，互联网保险应该注重以下几个方面：注重产品创新；注重线上和线下的结合；开展大数据分析；注重创新商业模式。

一、互联网保险

目前来看，对互联网保险没有形成一个统一的定义。根据保险协会对互联网保险的定义不发现，互联网保险主要指的是保险中介机构通过互联网为客户提供相关服务信息，实现以下几种业务：投保；承保；核保；保全；理赔等。互联网保险完成的在线服务和在线销售等功能，通过第三方机构实现电子支付等经营管理活动。互联网保险不仅仅是对传统保险商业模式的改革，而且还 是一种新的销售渠道。不管如何定义互联网，均需要从以下几个角度出发：

一是互联网保险产品。首先，以互联网作为保险业的销售渠道之后，保险企业应该要以客户为中心，开发适合互联网的保险产品；其次，随着互联网行业的不断发展，保险作为管理的有效手段，保险企业应该充分观察到潜在风险，开发互联网经济风险的保险产品，发挥出保险为社会经济发展的保护功能；

二是使用互联网技术和互联网思维经营管理保险企业。保险企业需要在互联网思维背景下制定相关经营战略，建立全新的经营体系，将开放和协作等互联网精神贯穿于保险经营管理的全过程中，为客户提供更为满意的服务；

三是在线经营保险业务。在线经营保险业务将保险产品信息展示和理赔等业务工作在网上去完成，代替传统电话服务和纸质服务；

四是在线销售保险产品。要想促进保险销售模式的多样化，必须 从传统的渠道上逐渐往互联网方向发展，积极借助新的技术和新的渠道，抓住时展的契机。

二、互联网保险发展中遇到的基本问题

（一）线上与线下结合比较弱

现阶段来看，互联网保险仅仅限于简单的保险品种，一些较为复杂的保险品种，如护理保险和人寿保险等需要保险工作人员进行推销和说明，一些金额比较大的理赔案例需要现场查勘。互联网无法完全代替人工服务，国内保险行业产品基本上都围绕着组织架构而建立，因此使得传统的保险公司很难从组织结构层面上做好互联网保险工作。

（二）创新保险产品不多

互联网保险销售目前以传统保险产品为主，创新型的 保险产品不够多。与此同时，互联网保险销售受地区经济发展水平的影响比较深刻，地区经济发达水平高低直接影响着保险工作人员是否能够深度发掘消费者 所需要的相关保险产品，最终 使得保险业务能够精确到每一位客户。

（三）创新商业模式比较薄弱

现阶段来看 ，保险企业主要是将互联网作为一种销售渠道，一旦没有利用好互联网模式，势必会改变保险业务的运作模式，最终改变整个保险行业的价值体系。保险参与者没有有效实现互联网平台的交流与沟通等，保险公司仅仅通过服务化和精英化方式来完成保险融合。

三、互联网保险的商业模式

（一）移动互联网销售模式

移动互联网销售模式主要利用的是手机 和平板电脑等设备提供相关服务。以国华人寿为代表的保险公司推出了微信公众服务凭条，相比起传统的销售渠道而言，移动互联网保险具有更贴近客户基本需求的优势；

（二）专业互联网保险企业模式

专业互联网保险企业通过专门设立的互联网保险企业来经营相关保险业务，我国太平洋保险和人寿保险等公司纷纷成立了电子商务公司，继而经营好互联网保险业务工作。即使专业互联网保险公司模式得到社会的关注，但是由于受到能力条件有限因素影响， 线上成交的运营模式在不断地尝试和探索中；

（三）官方网站模式

官方网站体现了网站主办者的意志，具有权威作用。互联网保险的官方网站模式主要指的是保险企业来展现保险产品信息，提供在线服务工作。一些颇有实力的保险企业更为注重品牌效应，为具有品牌忠诚度的客户提供网上购买的渠道，对产品的介绍也更为细致，用户也能够选择到更适合自己的保险产品。官方网站模式具有以下几个方面的特点：其一，有利于在公众面前树立良好的企业形象；其二，有利于降低对第三方网站平台的依赖；其三，有利于保险企业的自身品牌推广。

参考文献：

[1]郑祖军，张玲.浅谈我国互联网保险的商业模式[J].金融经济（理论版），2015，16（1）：50-52

[2]李红坤，刘富强，翟大恒等.国内外互联网保险发展比较及其对我国的启示[J].金融发展研究，2014，10（10）：77-83

篇3

[关键词] 计算机软件 源代码 专利 著作权法与商业秘密法结合保护

一、软件源代码的技术特征和商业运作机制

软件是指挥计算机解决某问题而编写的程序及相关文档的总称。计算机程序通常包括源程序和目标程序,又称源代码和目标代码。源代码是由开发者使用类似于自然语言和数学公式的高级语言或汇编语言,如C、Java、Basic、Fortran等编写而成,可供技术人员阅读、修改。而目标代码则是通过开发工具包将源代码直接编译,以0或1的二进制编码形式表示,能直接由计算机识别,操作并实现某项功能的程序。

从软件行业的技术特征来看,计算机程序开发的过程,首先从开发人员的技术思想开始,而这种新的技术思想、结构又需要,而且只能通过源代码的编写来实现。开发人员通常必须首先分析用户的实际需要和技术要求,明确此项软件最终应当实现的功能和用途,然后运用自己的专业技术知识,设计算法、确定结构,选择一种或几种最优或最适合的高级程序设计语言。接着,利用该语言的开发工具包所提供的语言环境和语法格式编制源代码,再利用工具包中自带的翻译程序将已经编码的源程序翻译成目标代码,由计算机自动识别和运行。初次试运行结束后,开发人员根据运行的实际结果对源代码进行进一步的修改和完善。如果初次运行失败,开发人员则需要使用调试功能查找问题,修改源代码,再次投入翻译和运行。一个新程序开发成功往往需要多次试运行并修改,直至得到最佳程序方案,方能将目标代码及用户手册提交用户,投入使用。当然,这其中也包含有软件开发失败,程序预期功能最终未能实现的风险。由此可见,软件开发最关键的技术核心,在于确定技术方案,编制源代码阶段。源代码具有可操作性、间接应用性,直接反映了开发者的思想和结构设计,决定了软件的技术含量和智力水平。

从软件行业的商业运作机制来看,由于软件从根本上说,仅仅是一种蕴含着技术思想的工具,根本目的在于实现某一特定功能,对于终端用户而言,其中所蕴含的技术是不必也无需知道的,因为只要其获得目标代码并在一定的环境下运行,计算机就可以自动识别并实现其所预期的技术功能,其所支付的购买成本即可以得到偿付。可以说,软件销售行业的商业运行对普通终端用户而言,仅仅是一种技术功能实现成本的交易。由于本身缺乏相应的技术知识和背景,获取源代码并知悉其中的技术思想对普通的软件消费者而言毫无意义,如欲规避该功能实现成本,只需要非法复制该软件的目标代码并在计算机上运行即可。因此,一般情况下,软件开发完毕之后,最终用户只能获得目标代码和用户手册,除非有特殊约定或公开许可,源代码是作为软件开发者的商业秘密,不予提供。然而,诚如上文所述,对于软件开发行业来说,源代码的地位却是至关重要的,获取了已有软件的源代码就可以轻易的获知其中的技术思想和诀窍,并在此基础上改进开发,或研究其漏洞,从而大大缩短原有的技术开发成本,研究出改进、替代产品,并从中获取商业利润。

二、软件源代码单一版权法保护的优势和不足

目前,除少数技术比较发达的国家允许纯软件专利(P21-22)之外,各国对计算机软件主要采用版权法保护模式。无可否认,版权保护能成为当今世界软件立法的主流,必然有其内在优势和可行性:首先,版权保护范围广泛。版权法对作品的创作水平要求较低,即所谓只须具有创造性火花(Creative Spark),而不必达到新颖的、完美的或巧妙的(Novel、Unique or Ingenious) (P24-25)。其次,版权自动保护原则,使源代码从编码完成即受保护,至多也只须进行注册登记,手续简便,成本低廉;最后,版权法保护范围有限。只保护表达,不保护创作思想,其他开发者可借鉴已有软件的技术思想进行创新和优化。

然而,源代码的技术性特征使得其不可能与传统版权法所有理念和内容完全吻合,国外有学者甚至认为:“包含计算机程序会导致著作权制度的歪曲 (P77-78)”。

1. 传统版权法的立法目的与源代码功能技术性特征不符。

正如通产省1983年《程序法建议》所述,“版权法的宗旨是促进文化发展,而软件保护则主要在于促进工业或其他产业的发展 (P100)”。日本1970年《著作权法》、韩国1987年《著作权法》及我国台湾地区《著作权法》均在第一条开宗明义地规定,本法的目的是为促进国家文化向上发展 (P1-2)。事实上,版权的产生和发展,源于人类对自身精神领域的关注,是对人类传播思想、文化、艺术,从阅读、欣赏、评价中得到思想升华和精神愉悦的肯定。而源代码则与此完全不同,其开发、编写、内容、表达都具有鲜明的实用目的和功能性用途,

2. 传统版权法以文化作品为标准的概念和规则在源代码领域不适用。

按照上述立法目的,传统理论将版权保护的作品界定为“对文艺、学术、美术以及音乐范围内的思想及感情的创造性的表达” (P447)。而源代码从产生时起,就是一种实用技术工具。虽然表达具有文字属性,但仅用于转换为机读的指令序列,即由机器识别、执行,这与传统作品的作用大不相同。因此,有学者认为,“程序本身几乎没有或根本没有任何实际意义,其意义只有在计算机运行的过程中才能显示出来。因此,它作为作品的法律地位在某种程度上是无效的 (P204)”。

3. 传统版权法思想――表达二分法的基本原则与源代码的“双重属性”的冲突。

版权法仅保护富有创意的表达,并不延及创意本身和技术功能,这已成为国际版权保护的共识。只要是非抄袭的独立创作且表达方式有异,即使与已有作品思想雷同,亦符合版权原创性要求。然而,源代码兼具表达与技术双重属性,其根本价值在于作者的技术构思和功能性步骤设计。同时,其表达的多样性受到诸多限制。这就可能产生十分不合理的结果:一方面,某些基础功能的最优编码方式可能仅有一种,保护此表达,实际上就间接垄断了该技术思想。另一方面,只要了解软件源代码的技术思想,再以不同的表达方式重新编写,就能轻易规避版权保护。这一弊端,是软件版权保护最易受攻击的弱点。

另外,文学作品的版权保护期限较长,一般为作者终身加死后50年。而大多数软件寿命较短,只有几年使用时间。因此,50年的保护期对软件而言意义不大。

三、软件源代码单一商业秘密法法保护的优势和不足

从一定意义上讲,软件的商业秘密保护是一种“收底”的保护方式,由于其具有很强的灵活性和主动性,在保护软件源代码领域具有明显优势。

1. 它满足了权利人垄断性权利与技术不公开的双重要求,在避免专利理念冲突的同时,保护了源代码中的技术思想。

源代码是软件开发的技术核心,是开发人员最重要的智慧财富。对此,专利法无法逾越其公开要求,而版权法则对保护思想无能为力。商业秘密保护则正好弥补了二者的缺陷,它保护技术思想和功能,同时并不要求公开,甚至还特别要求权利人必须采取保密措施。这就满足了权利人垄断并不愿意公开技术的双重要求。当然,不公开技术也就相应的无法享受专利法的绝对垄断,商业秘密法保护的力度和效力较之专利法而言明显较弱,然而事实上,这种相对弱势的保护方式对于软件业的技术革新而言是不无裨益的。

2. 其保护门槛低,保护力度和期限灵活,权利人有充分的自主性,非常适合软件行业周期短,革新快,竞争激烈的行业特征。

3. 对开发者未来潜在利益的保护:首先,可以有效防止他人在其软件基础上进行后续开发。其次,可以低成本垄断技术及其更新,维护软件产品的后续利益。如后期技术服务、漏洞补正、界面和扩展性的完善等,微软公司在操作系统 Windows3.1的基础上不断推出Windows95、98、Professional及至Windows XP,就是最好例证。最后,可以维护软件安全性,防止因源代码泄露而被他人利用产品安全漏洞攻击计算机网络。

然而,单一商业秘密保护也存在弊端:首先,商业秘密法的保护力度有限,往往只能通过软件销售协议或雇用合同中的保密条款主张相关违约或侵权责任,或者依靠开发者自身的保密措施,难以达到令人满意的效果。其次,商业秘密法无法禁止合法获取秘密信息后完全复制和使用。商业秘密法只禁止对源代码的非法获取,不禁止“通过公平和诚实的方法”获取,按照TRIPS规定,主要指“公平诚实的反向工程和独立开发”。因此,若第三人破译了权利人的技术保护,用反向工程获取源代码,就有权对其进行任何形式的使用,包括在新软件中完全照搬,形成内容和功能都完全相同的软件。当然,在现实生活中,这种原封不动的照搬并无意义,因为盗版目标代码即可达到同样效果。事实是第三人往往以反向工程复制部分源代码用于自己的软件,产生功能有所差异的新软件。对此,商业秘密法无能为力。

四、软件源代码版权与商业秘密保护的良性互补

在软件保护领域,版权法与商业秘密法可否并存?对此,美国第二巡回上诉法院在“阿尔泰”一案中确认了二者的并存及各自适用的范围 (P18)。”事实上,“版权与商业秘密在软件保护中建立了一种精妙的良性互动关系,他们彼此间的支持与配合,既可以克服单一版权保护的‘先天不足’,又可以避免软件专利保护的不当。二者的结合,在不冲击现有知识产权体系和符合社会公共政策目标的同时,为软件业,特别是软件源代码,提供了有效、正当的保护(P50)”。

1. 商业秘密法保护侧重于保护对象的内容,兼顾了软件源代码的技术思想和文字表达,实现了对源代码双重属性的“双重保护”,弥补了版权法的保护漏洞。

源代码兼具表达的文字性和功能的技术性,其技术思想和结构是开发人员最重要的智慧财富。但版权法受其立法目的所限,严格依照“思想―表达两分法”界定保护范围。商业秘密法则恰好兼顾了这种双重要求:从立法目的上看,商业秘密保护关注的不在于表达本身,而在于表达信息的内容;从保护对象上看,其既保护“表达”,也保护“思想”,任何采取不正当手段或违约获取和使用“信息”的行为都在禁止之列。这就满足了权利人对软件源代码技术思想的关注,有效弥补了版权法保护的缺漏。同时,商业秘密法保护期限、力度的灵活性也弥补了版权法保护期限和范围僵化的不足。

2. 版权法则有效克服了商业秘密法保护的不足。商业秘密法无法解决的保护力度有限,无法防止合法取得而引发的复制和后续使用的问题完全可以用版权法来补充:一旦源代码取得著作权,就意味着即使合法获得,对其进行任何形式的复制和直接使用,甚至是非常类似的表达都将构成侵权。

总之,在版权法和商业秘密法的结合保护体系下,版权自动产生,不以权利人公开为条件,同时,版权法并不禁止将同一作品的一种表现形式(源代码)予以保密,而同时公开该作品的另一种形式(目标代码)。因此,权利人完全可以发行目标代码满足普通用户的使用,而将源代码作为商业秘密严加保护。版权法和商业秘密法分别保护源代码的“表达”和“思想”,各司其职,相互协调。

此时,对源代码的获取和使用就存在以下四种情况:(1)若他人非法获悉源代码并进行复制,则构成对版权和商业秘密的双重侵犯;(2)若其非法获取源代码,但仅阅读并理解其中的结构思想,未复制其表达(如,为发现漏洞编写病毒程序),则只构成对商业秘密的侵犯;(3)若其采用反向工程等合法手段突破权利人的保密措施获取源代码,并将其用于新软件的编码过程,则只构成版权侵权;(4)若其合法获取源代码后仅抽取其中的思想重新编码,且不构成与权利人源代码的实质相似,则不构成侵权。

当然,软件源代码的这种双重保护体系,还需对版权法和商业秘密法本身进行必要的修改和协调,如扩展版权法立法宗旨和对象,修改以传统文化作品为标准的各项概念和规则以及涤清二者各自的适用范围和具体内容等。

参考文献:

[1]应 明:计算机程序专利保护在美国的发展趋势[J].知识产权.2001.(1)

[2]Information Infrastructure Task Force.Intellectual Property and the National Information Infrastructure.The Report of The Working Group On Intellectual Property Right.Sep.1995

[3][西班牙]德利娅.利普希克.著作权与邻接权[M].北京:中国对外翻译出版公司,2000

[4]参见日本通产省《程序建议法》中所列举版权保护的弊端第2条,转引自郑成思.知识产权论[M].北京:法律出版社,1998.

[5][台]萧雄淋.新著作权法逐条释义(一). 台北:五南图书出版公司印行,中华民国87年7月

[6][日]金井重彦.著作权的基础知识――计算机软件[M] .1992.17. 转引自:曾彤. 日本计算机软件复制权侵权的认定与抗辩[A]. 曾彤、唐广良主编.知识产权研究(第十六卷)[C].北京:中国方正出版社,2004.

[7][美]阿瑟.R.米勒、麦克尔.H.戴维斯. 知识产权概要[M].周林、孙建经、张淑译. 北京:中国社会科学出版社,1997

[8]沈新康、史金红.泄露计算机软件源代码行为的法律性质及其责任[J].人民检察.2003(2)

[9]Donald S. Chisum & Michael A. Jacobs: Understanding Intellectual Property Law. 3E[3](1992) . 转引自蒋坡.计算机法律保护通论[M].上海:上海大学出版社,1998.7

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摘要：目的 研究乌饭树树叶及其提取物对视网膜免受光损伤的保护功能。方法 将20只新西兰白兔分成4组：正常对照组和模型对照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。正常对照组动物自由摄取饲料，自由饮水；模型对照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组动物除自由摄取饲料，自由饮水外，每天分别喂乌饭树新鲜树叶[50g/(kg・d)]、乌饭树陈旧树叶[50g/(kg・d)] 和乌饭树树叶提取物[50mg/(kg.d)]，连续4周。并且进行强光刺激，同时利用视网膜电图(ERG)进行视网膜分析，最后处死白兔测定视网膜中丙二醛(MDA) 的含量和总超氧化物岐化酶(TSOD)的活力。结果 ERG测定结果发现，对照组B波的潜伏期时间延长而振幅降低，模型组白兔ERG的变化趋势正好相反。同时模型组视网膜中的MDA含量要低于对照组(P

关键词：乌饭树；提取物；视网膜；光损伤

The protective effect of Vaccinium Bracteatum Thunb leaves　and the extract against light injury of retina

Wang Li， Zhang Xuetong， Yao Huiyuan

(School of Food Science and Technology， Southern Yangtze University， Wuxi 214036;Department of Ophthalmology of the Wuxi No.4 Peoples Hospital， Wuxi 214036， China)

ABSTRACT: Objective To investigate the protective effect of the extract of Vaccinium Bracteatum Thunb (VBT) leaves against light injury of retina. Methods 20 Newzealand rabbits were pided into 4 groups: the normal control group， modelⅠgroup， modelⅡ group， and model Ⅲ group. The normal control group ate and drank freely. modelⅠgroup ate and drank freely but took in 50g/(kg・d) fresh VBT leaves daily for 4 weeks. model Ⅱgroup ate and drank freely， but took in 50g/(kg・d) old VBT leaves daily for 4 weeks. model Ⅲ group ate freely， but took in 50mg/(kg・d) extract of VBT leaves(resolved in water) daily for 4 weeks. All rabbits were exposed to strong light， meanwhile， the retinas were analyzed by electroretinogram (ERG) every week. Finally， all the rabbits were killed and the content of MDA and SOD in the retina were detected. Results In the control group， the latency time of the B wave increased and the amplitude of the B wave shortened， while in the model Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ groups， the changes of B wave just opposite. The content of MDA in the model Ⅰ，Ⅱ， and Ⅲ groups was lower than that in the control group(P

KEY WORDS: Vaccinium Bracteatum Thunb(VBT); extract; retina; light injury

乌饭树是杜鹃花科的一种植物，我国南北各地均产，很多中药类书籍中都记载其对人体具有保健作用[12]。国外对乌饭树同种属植物的果实进行研究发现，其对多种眼科疾病均有很好的治疗效果，目前很多国家都已经把乌饭树紫黑浆果中提取出的色素类物质用于眼科医疗领域。意大利、法国、西班牙、韩国、美国以及新西兰等国家已经将其应用于夜盲症、毛细管脆弱、脑血管障碍、胃溃疡的治疗[34]。本研究采用强光刺激损伤白兔视网膜，同时喂食乌饭树树叶或其提取物，利用视网膜电图技术(electroretinogram， ERG)对白兔视网膜进行研究，然后对视网膜进行丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)含量分析，最后对其保护机理进行了初步的探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新西兰大白兔20只，购自江南实验动物场，体重(2.5±0.5)kg。

1.1.2 药品与试剂 乌饭树树叶，购自于江苏溧阳；乌饭树树叶提取物，实验室自制；美多丽眼液，参天制药株氏会社(日)；倍诺喜眼液，参天制药株氏会社(日)；总蛋白含量测试盒，购自于南京建成生物研究所； MDA含量测定试剂盒，购自于南京建成生物研究所； SOD活力测定试剂盒，购自于南京建成生物研究所；PBS(磷酸盐缓冲液)：800mL蒸馏水中溶解8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾，用盐酸调节pH至7.4，加水定容至1L，在1.034×105Pa高压下杀菌20min，保存于室温。

1.1.3 主要仪器 全视野闪光刺激器，重庆医用电子仪器厂；视觉电生理检查与诊断系统VETSⅢB，重庆医用电子仪器厂。

1.2 方法 20只新西兰大白兔适应性喂养1周，自由摄取饲料，自由饮水。然后用1000W强光照射，刺激眼睛视网膜产生光损伤，同时按照不同的组别进行喂养食物，每周进行ERG的测量。具体分组如下：正常对照组：自由摄取饲料，自由饮水。模型对照Ⅰ组：自由摄取饲料，自由饮水，另外每天喂乌饭树新鲜树叶，按照50g/(kg・d)剂量喂养，连续4周。模型对照Ⅱ组：自由摄取资料，自由饮水，另外每天喂乌饭树陈树叶，按照50g/(kg・d)剂量喂养，连续4周。模型对照Ⅲ组：自由摄取饲料，另外每天喂乌饭树树叶提取物(溶解于饮水中)，按照50mg/(kg・d)剂量喂养，连续4周。

1.2.1 ERG的测量 记录电极为角膜式接触电极，参考电极和接地电极为普通电极。预先用剪刀剪去白兔额部毛，再用剃须刀刮干净。进行ERG测量操作前先用美多丽眼液对白兔进行扩瞳，暗适应30min，眼角膜用倍诺喜进行麻醉。分别利用蓝光、白光和红光对白兔视网膜进行刺激(在白光刺激后明适应30min再进行红光刺激测定)。记录电极置于兔子眼角膜表面，参考电极置于靠近兔子额部，用胶布固定，接地电极置于兔子耳朵上，用胶布固定。测量时，兔子头部置于刺激球中央，对单只眼睛视网膜进行刺激。刺激条件：高频85Hz，低频0.1Hz，刺激光亮度1.5Log，单次刺激。记录仪进行同步记录，经过仪器分析得到B波的延滞时间(以ms为单位)和振幅(以μV为单位)，进行分析。

1.2.2 视网膜匀浆的制备 于实验30d后将白兔处死，摘除眼球，仔细去除眼内容物，剥离视网膜，置于冰冷的玻璃匀浆器中，冰浴下碾磨5min，制成匀浆，10000r/min高速离心15min，取上清液待用。

1.2.3 总蛋白含量的测定 蛋白质上的氨基(-NH3+)与考马斯亮兰染料上的阴离子结合，能够使溶液从棕红色变为蓝色，通过测定吸光度值可以计算出其中的蛋白质含量。取组织匀浆50μL，按照试剂盒配制试剂，并且进行测量。

1.2.4 MDA的测定 过氧化脂质的分解产物-MDA与硫代巴比妥酸作用后形成红色物质，利用分光光度计测定吸光度，可以计算出其中的丙二醛含量。按照试剂盒配制试剂，并且进行测量。

1.2.5 总超氧化物岐化酶(TSOD)活力的测定 通过黄嘌呤以及黄嘌呤氧化酶反应体系产生超氧阴离子自由基[O-2・]，氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，当样品体系中含有SOD时，则对[O-2・]有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值要低于对照管的吸光度，通过计算可以得出视网膜中SOD的活力。按照试剂盒配制试剂并且测量。

2 结果

2.1 ERG测定结果 ERG分别由PⅠ、PⅡ和PⅢ三个导程构成，B波是ERG中属于其中的PⅡ导程部分，紧随A波后的一个正相波。它起源于光感受器与神经节细胞之间的神经通路中的一种光兴奋活动，可能来自双极细胞或Müller细胞。它反映视网膜内核层区域细胞的电活动，并且反应非常迅速，受外界因素的影响较为明显，如缺氧、温度变化以及不同的光刺激等，因此B波作为评价视网膜功能可靠而灵敏的客观指标之一，近年来越来越受到重视。在本研究中测定白兔在受强光刺激后暗视ERG、暗反应最大波和明视ERG中B波的变化。在实验中采用三种光(蓝光、白光、红光)对白兔视网膜进行刺激，其中蓝光测定值代表的是暗视ERG，白光测定值代表的是暗反应最大波，而红光测定值代表的是明视ERG。具体结果见表1-3。

2.2 白兔眼睛视网膜抗氧化指标的检测结果 实验30d后，将白兔的视网膜取出，进行适当的处理，测定其中的MDA和TSOD含量，前者可以反映视网膜脂质过氧化的程度，而后者则反映其中抗氧化酶体系活力的变化。具体结果见表4。

表1 白兔暗适应ERG――B波的潜伏期及振幅的变化（略）

Table 1 The change of the latency time and the amplitude of the B wave of the dark adaptation ERG of the rabbits

Model Ⅰ：fed with fresh leaves; Model Ⅱ: fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ: fed with the extracts from leaves

*P

表2 白兔暗反应最大波――B波的潜伏期及振幅的变化（略）

Table 2 The change of the latency time and the amplitude of the B wave of the scotopic threshold response of the rabbits

Model Ⅰ：fed with fresh leaves ; Model Ⅱ:fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ:fed with the extracts from leaves

*P

表3 白兔明视ERG――B波的潜伏期及振幅的变化（略）

Table 3 The change of the latency time and the amplitude of the B wave of the photopic ERG of the rabbits

Model Ⅰ: fed with fresh leaves; Model Ⅱ:fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ: fed with the extracts from leaves

*P

表4 不同实验组别白兔眼睛视网膜抗氧化酶体系的检测结果（略）

Table 4 The contents of the MDA and SOD in the retina of different groups

Model Ⅰ: fed with fresh leaves; Model Ⅱ: fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ: fed with the extracts from leaves

*P

3 讨论

从表1-3中可以看出，随着实验时间的延长，对照组B波的潜伏期逐渐延长，而模型组(Ⅰ-Ⅲ)则都在一定程度上有所降低，而B波振幅的变化趋势正好相反。

由于视杆细胞对蓝光敏感，因此暗视蓝光ERG主要反映的是眼睛视网膜中视杆细胞的变化。从表1中的变化趋势可以看出，乌饭树树叶和其提取物对视杆细胞具有明显的改善作用。

视锥细胞对红光敏感，所以明视ERG主要反映的是眼睛视网膜中视锥细胞的变化。从表2中的变化趋势可以看出，乌饭树树叶和其提取物对视锥细胞同样具有明显的改善作用。

暗反应最大波是视网膜明视系统和暗视系统的混合反映，其中的B波是视杆细胞兴奋后产生的电位变化，可能起源于Müller细胞或双极细胞。其反映视网膜内核层区域细胞的电活动，取决于视网膜内信号传递过程的完整性[5]。从表3可以看出，乌饭树树叶和其提取物对于视网膜的视觉系统有很强的维护作用。

从表1-3还可以看出新鲜树叶和陈树叶对于视网膜的保护作用基本一致，说明在新鲜树叶储藏期间没有功能性物质的损失，或者是损失很少，这样也就可以为原料的储藏提供了一些依据。

MDA是脂质过氧化的产物，通常被用来衡量脂质过氧化的程度。视网膜的视细胞外节主要是盘膜结构，内含丰富的长链多不饱和脂肪酸，在受到光的作用后，易从位于两个双键之间的亚甲基上脱去氢原子，形成质子自由基，然后发生双键和未配对电子位置的转移，形成较稳定的共轭双键，再与氧反应，形成质子自由基和质子过氧化物。这些自由基再攻击其他不饱和脂肪酸，引起连锁反应，从而使盘膜以及线粒体膜和内质网膜的脂类受到损害。

环境光的损伤被认为是一种光化学损伤。感光器外段富含长链不饱和脂肪酸，内段富含线粒体，对氧的需求大，当光子被视紫红质吸收后可产生一系列的自由基，它们与感光器和视网膜色素上皮(RPE)中的不饱和脂肪酸发生反应，发生脂质过氧化反应，引起眼睛组织破坏。从表4中可以看出，对照组的白兔眼睛视网膜中MDA的量大大超过正常白兔眼睛视网膜中的量[6]，说明实验中的强光刺激对白兔眼睛有了很严重的损伤；而模型组Ⅰ-Ⅲ的白兔视网膜中的MDA含量接近于正常白兔眼睛视网膜中的量，说明白兔食用乌饭树树叶或树叶提取物后，视网膜内部的脂质过氧化得到了有效的抑制。其主要原因应该是由于乌饭树树叶含有丰富的黄酮类物质[4]，黄酮类物质具有很强的清除自由基能力，而视网膜光化学损伤的主要发病机制是脂质体过氧化[7]，所以在实验中服用乌饭树树叶或其提取物的白兔视网膜受到很好的保护。

视细胞中含有大量的线粒体，其中的呼吸链在进行电子传递时可产生自由基，如辅酶Q是醌类化合物，通过氧化还原可生成半醌自由基。视细胞中的视黄醛或视黄醇受可见光照时也可产生自由基。许多研究表明，视网膜的光损伤是光照激发产生自由基，引起组织发生过氧化的结果。在正常情况下，机体内自由基的产生与清除过程处于动态平衡，在遭受各种外界因素的影响时，平衡被破坏，机体受损。视网膜本身具有一定的抗氧化能力，在一定程度上可以预防光化学损伤。它各层均存在清除自由基的天然保护系统，包括抗过氧化物酶和自然抗氧化剂[8]，它们可以通过各种化学反应而终止自由基链反应，达到清除有害自由基，防止组织破坏的目的。从表4可以看出，对照组白兔眼睛视网膜中SOD要远低于其他3个模型组，说明乌饭树树叶以及其提取物能够有效地保护视网膜中的SOD，使其能够保持活性。视网膜抗氧化能力下降时，容易受到光的损伤，反之在受到光的刺激损伤后，视网膜中的抗氧化酶体系必定发生变化。从表4可以看出，对照组的白兔眼睛视网膜中SOD的量大大低于正常白兔眼睛视网膜中的量[6]。有实验表明，光照可以使细胞内SOD水平下降[9]，而SOD是生物体内自由基清除剂之一，可以促进超氧化物阴离子自由基的岐化反应。在本研究中可能的机理是乌饭树树叶及其提取物能够将超氧阴离子自由基[O-2・]转变为O2和H2O，清除其毒性作用，减轻和防止过氧化，从而达到保护视网膜的作用。同时，从表4可以得出结论，新鲜树叶和陈树叶可以达到基本一致的效果。

综上所述，乌饭树是一种很丰富的天然资源，其功能在很多中药典籍中都有记载，但是目前的应用不是很广泛，原因是人们对它的功能和具体的作用机理不了解。本研究发现乌饭树树叶或其提取物能够有效地预防保护视网膜免受光损伤，服用50g/(kg・d)的乌饭树树叶或者50mg/(kg・d)的提取物，可以起到明显的效果。

参考文献：

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[5]吴乐正，正. 临床视觉电生理学 [M]. 北京:科学出版社， 1999:1620.

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[7]谢伯林，严密，张军军. 视网膜光化学损伤的主要组织化学改变实验研究 [J]. 中华眼底病杂志，1998，14(1):38.

篇5

【摘要】 目的: 探讨腹腔注射银杏叶提取物（Ginkgo biboba extract，EGb 761）对豚鼠视神经横断伤后视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell， RGC）形态及功能的保护作用。方法: 75只白化豚鼠随机等分为正常对照组、假手术组、模型组、生理盐水组和EGb 761组。分离暴露豚鼠的右眼视神经并于球后1.0 mm处进行横断造模，正常对照组不作任何处理，假手术组仅分离暴露视神经。生理盐水组和EGb 761组分别于实验开始前1周每日腹腔注射1次相应体积生理盐水和EGb 761（100 mg/kg），术后继续给药4周。术后第4天，各组随机处死3只豚鼠，采用脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferasemediated deoxyuridine triphosphatebiotin nick endlabeling， TUNEL)法检测RGC凋亡；分别于术后第14和28天进行图形视网膜电图（pattern electoretinogram， PERG）检查；摘取眼球作组织病理学检查并计数视网膜垂直经线RGC数目。结果: 术后第4天，正常对照组、假手术组和EGb 761组均未见TUNEL阳性RGC，模型组和生理盐水组均见有TUNEL阳性RGC。术后第14和28天，模型组和生理盐水组RGC数目均少于正常对照组和假手术组（P

【关键词】 银杏叶提取物; 视神经损伤; 视网膜神经节细胞; 图形视网膜电图; 神经保护; 豚鼠

Objective: To investigate the effects of Ginkgo biloba extract (EGb 761) on the morphology and function of retinal ganglion cells (RGC) in guinea pigs with optic nerve transection.

Methods: Seventyfive albino guinea pigs were randomly pided into five groups: normal control group， shamoperated group， untreated group， normal saline group and EGb 761 group. No operation was performed in the normal control group. Optic nerve was merely exposed in the shamoperated group， but transected at 1.0 mm from posterior pole of the eye ball in the untreated， normal saline and EGb 761 groups. Guinea pigs in the EGb 761 group or the normal saline group received daily intraperitoneal injection of EGb 761 (100 mg/kg) or corresponding volume of normal saline from 7 days before experiment to 28 days after experiment. Three guinea pigs in each group were sacrificed for apoptosis assay (TUNEL method) of RGC. Pattern electoretinograms (PERGs) were recorded 14 and 28 days after transection， respectively. At the end of the examination， six guinea pigs were killed for histological examination and RGC count.

Results: No TUNELpositive cells were observed in the normal control， shamoperated and EGb 761 groups， but there were TUNELpositive cells in the untreated group and the normal saline group. The numbers of RGCs in the untreated and normal saline groups were less than those in the normal control and shamoperated groups at 14 days or 28 days (P

Conclusion: EGb 761 can inhibit the apoptosis of RGCs in guinea pigs after optic nerve transection， thus protect the morphology and function of RGCs.

Keywords: Ginkgo biloba extract; optic nerve lesion; retinal ganglion cell; pattern electroretinogram; neuroprotective effect; guinea pigs

青光眼是一种威胁视神经视觉功能，主要与眼压升高有关的眼病，也是目前我国第二大致盲眼病。虽然青光眼的具体发病机制尚不清楚，但目前一致认为视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell， RGC）凋亡为青光眼神经损害的中心环节。研究证明银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract，EGb 761）具有抗氧化［1］、抗缺血［2］、保护线粒体［3］和抑制一氧化氮合酶活性［4］等广泛的生物学效应。因此，我们采用横断豚鼠球后视神经的方法建立RGC损伤模型观察EGb 761对RGC结构的保护作用，并采用图形视网膜电图（pattern electroretinogram， PERG）评价EGb 761对RGC功能的保护作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 75只雌性白化豚鼠，体质量190～210 g，购于中国科学院上海实验动物中心，许可证号为SCXK（沪）2007005。

1.1.2 实验药物及试剂 EGb 761，17.5 mg/支（5 mL），批号为9941209C，德国威玛舒培博士大药厂产品；速眠新Ⅱ注射液，又名846合剂，1 mg/mL，军事医学科学院军事兽医研究所产品，批号为(2004)005013；陆醒宁注射液，1 mg/mL，军事医学科学院军事兽医研究所产品，批号为(2006)006011；甲基纤维素，上海建华精细生物制品有限公司产品；脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated deoxyuridine triphosphatebiotin nick endlabeling， TUNEL）检测试剂盒，美国Promega公司产品；碘化丙啶（propidium iodide，PI），美国Sigma公司产品。

1.1.3 实验设备 手术显微镜（SM2000J，上海轶德医疗设备有限公司）；PERG检查仪(EP1000，日本Tomey公司)；荧光显微镜（Axioplan 2，德国Zeiss公司）；光学显微镜（Olympus BX50，日本Olympus公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组 豚鼠使用严格遵循视觉与眼科研究协会（Association for Research in Vision and Ophthalmology， ARVO）有关视觉和眼科研究动物使用条款。所有豚鼠均在12 h明/12 h暗，温度为22～25 ℃，湿度为55%～60%的环境中饲养。采用计算机随机数字法将75只豚鼠分为5组：正常对照组、假手术组、模型组、模型+生理盐水组（生理盐水组）、模型+EGb 761组（EGb 761组），每组15只。每只鼠的右眼为实验眼，左眼为用于计算RGC存活指数的对照眼。

1.2.2 视神经横断方法 按照Nakazawa等［5］报道的方法进行视神经横断，建立豚鼠视神经横断模型。臀部注射速眠新Ⅱ注射液0.6 mL/kg麻醉后，在手术显微镜下剪开外眦角；自12∶00处沿角膜缘逆时针呈180°打开球结膜并向后钝性分离暴露视神经，钝性分离视神经鞘表面的血管后于球后1.0 mm处横断球后视神经。分别缝合球结膜和外眦角，涂金霉素眼膏。手术结束后立即在臀部注射陆醒宁（1.2 mL/kg）催醒。术中尽可能钝性分离血管以不影响眼球的血液供应，同时尽可能减少对视神经的牵拉。

1.2.3 各组处理方法 正常对照组：不给任何处理；假手术组：按造模方法暴露视神经，但不横断；模型组：按上述视神经横断方法横断视神经；生理盐水组：于实验前7 d腹腔注射生理盐水，每日1次，体积参照EGb 761的剂量，视神经横断后继续注射28 d；EGb 761组：于实验前7 d腹腔注射EGb 761，剂量为100 mg/kg［6］，每日1次，持续至视神经横断后继续注射28 d。视神经横断后第4天，各组随机处死3只豚鼠，摘取眼球作石蜡切片，进行RGC凋亡的TUNEL标记检测。分别于视神经横断后14 d和28 d进行PERG检查，检查后每组处死6只豚鼠作视网膜组织病理学检查，并作RGC计数。

1.2.4 TUNEL检测RGC凋亡 按TUNEL检测试剂盒说明书提供的方法进行石蜡切片和常规脱蜡。用蛋白酶K孵育后滴加TUNEL反应混合液，最后用PI衬染细胞核。经上述处理后，在荧光显微镜下进行观察并采用AxioVision软件进行同步图像采集，视网膜组织中凋亡的RGC细胞核呈黄色荧光着色。

1.2.5 组织学检查及RGC存活指数计算 分别于造模后第14和28天采用速眠新Ⅱ注射液(0.6 mL/kg)腹腔注射麻醉后，按我们以往的方法［7］，在角膜缘12∶00位缝线作标记并摘取眼球固定于10%甲醛液中，眼球摘除后再注射过量麻药处死。眼球固定24 h后沿12∶00至6∶00经线并沿视神经中央对剖开眼球，弃去晶状体和玻璃体，保留眼球壁。常规脱水、包埋、连续切片（3张）、苏木素伊红染色、封片。在光学显微镜下，从12∶00至6∶00锯齿缘（经视盘中央），计数整个经线上RGC核的数目，以其左眼作对照计算RGC的存活指数［8］，每眼计数3张，取其平均值。计算公式：存活指数=（右眼垂直经线RGC数目/左眼垂直经线RGC数目）×100%。

1.2.6 PERG记录方法 按BenShlomo等［9］报道的方法记录PERG。采用日本Tomey系统，软件为EP1000 Vision 1.2.3，刺激方式为棋盘格，刷新频率为65 Hz，通频带设为5～100 Hz，平均叠加次数30～60次，取样频率为2 000 Hz，刺激间隔时间为338 ms。豚鼠在自然光适应状态下，用速眠新Ⅱ注射液麻醉后固定于一个可以三维移动的动物实验台上（自制）。记录电极为环形氯化银电极，滴加14 mg/mL甲基纤维素后固定于右眼角膜缘处，不锈钢针制作的参考电极和地极，分别置于被检眼同侧颞侧皮下和背部。豚鼠的角膜缘与荧光屏平行，角膜顶点与刺激野中心距离为20 cm，然后于明适应状态下记录。每眼记录3次以上，取其平均值。按照国际临床视觉电生理学会（International Society for Clinical Electrophysiology of Vision， ISCEV）推荐的方法从P50的波峰至N95的波谷测量N95振幅［10］。

1.3 统计学方法 所有数据采用x±s表示。采用SAS 6.12统计软件包进行单因素方差分析，如差异有统计学意义，则进行各组均数间两两比较（StudentNewmanKeuls test， SNK）；RGC数目和P50波振幅相关性检测采用直线相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 EGb 761对RGC凋亡的影响 凋亡细胞的细胞核在3通道激发光下呈绿色荧光着染，所有细胞核在5通道激发光下呈红色荧光着染，在8通道激发光下凋亡细胞的细胞核呈黄绿色或黄色荧光着染。正常对照组和假手术组视网膜神经节细胞层均未见黄色荧光着染的RGC。模型组和生理盐水组均见有较多强荧光着染的RGC。EGb 761组未见荧光着染的RGC。见图1。

2.2 光学显微镜观察 豚鼠视网膜可见清晰的10层组织学结构，但全层无血管样结构。正常对照组神经纤维层较厚，RGC呈立方形，排列紧密，胞浆丰富，核饱满，染色较均匀，而胶质细胞胞体较小，核深染。假手术组除RGC略为稀疏外，与正常对照组无明显差异。视神经横断后28 d，模型组和生理盐水组RGC的数目明显减少，神经纤维层明显变薄且RGC稀少，胞体变小。EGb 761组RGC胞体与正常大小无明显区别，但数目略少。见图2。

2.3 EGb 761对RGC存活指数的影响 正常豚鼠视网膜垂直经线上RGC的数目为（318±13）个。视神经横断后14 d时，模型组与生理盐水组RGC存活指数显著低于正常对照组和假手术组（P

图1 TUNEL检测EGb 761对RGC凋亡的影响（荧光显微镜，×400）（略）

Figure 1 Effects of EGb 761 on RGC apoptosis checked by TUNEL (Fluorescein microscopy， ×400)

GCL: Ganglion cell layer; INL: Inner nuclear layer; ONL: Outer nuclear layer; TUNEL: DeadEnd fluorometric terminal deoxynucleotidyl transferasemediated deoxyuridine triphosphatebiotin nick endlabeling; PI: Propidium iodide. A: Normal control group， no TUNEL positive RGCs; B: Shamoperated group， no TUNELpositive RGCs in retina; C: Untreated group， a few TUNEL positive RGCs (white arrows) presented in retina; D: Normal saline group， a few TUNELpositive RGCs (white arrows) presented in retina; E: EGb 761 group， no TUNELpositive RGCs presented in retina.

图2 HE染色观察EGb 761对视网膜组织结构的影响 (光学显微镜，×400)（略）

Figure 2 Effects of EGb 761 on retinal structure observed by HE staining (Light microscopy， ×400)

GCL: Ganglion cell layer; INL: Inner nuclear layer; ONL: Outer nuclear layer. A: Normal control group. There was no vascular structure in retina， and cubic RGCs arrayed regularly and the nerve fibers layer (NFL) of retina was thick. B: Shamoperated group. The number of RGCs was close to that in normal control group. C: Untreated group. The number of RGCs and the thickness of NFL were obviously less than those in normal control group. D: Normal saline group. RGCs were rare and NFL was very thin. E: EGb 761 group. The number of RGCs and the NFL were slightly less than those in normal control group. All cells white arrows pointed at were RGCs.

图3 视神经横断后14和28 d各组RGC存活指数（略）

Figure 3 Survival index of RGC in each group 14 and 28 days after optic nerve transection

A: Normal control group; B: Shamoperated group; C: Untreated group; D: Normal saline group; E: EGb 761 group. Data were represented as x±s， n=6. *P

2.4 EGb 761对PERG N95振幅的影响 视神经横断14 d时模型组和生理盐水组N95振幅下降，显著低于正常对照组、假手术组和EGb 761组（P0.05）。视神经横断28 d时模型组和生理盐水组N95振幅进一步下降，显著低于正常对照组、假手术组和EGb 761组（P0.05）。见图4和图5。

2.5 N95振幅与RGC存活指数的相关性 对N95振幅和RGC的存活指数进行相关分析，结果为N95振幅与RGC的存活指数呈正相关关系，相关系数r为0.858 68（P=0.001 5）。见图6。

图4 视神经横断后14和28 d各组N95 振幅的变化（略）

Figure 4 Changes of N95 amplitude in each group 14 and 28 days after optic nerve transection

A: Normal control group; B: Shamoperated group; C: Untreated group; D: Normal saline group; E: EGb 761 group. Data were represented as x±s， n=6. *P

图5 视神经横断后28 d各组PERG波形（略）

Figure 5 PERG wave form in each group 28 days after optic nerve transection

N35: Negative wave 35; P50: Positive wave 50; N95: Negative wave 95. A: Normal control group; B: Shamoperated group; C: Untreated group; D: Normal saline group; E: EGb 761 group.

图6 N95振幅与RGC存活指数的相关关系（略）

Figure 6 Correlation of N95 amplitude with survival index of RGC

3 讨论

EGb 761主要含有黄酮苷（24%）和萜类内酯（6%）两种成分。黄酮类化合物主要有槲皮素、山奈黄素、异鼠李素。萜类内酯除银杏内酯外还有银杏苦内酯A、B、C和J。该制剂可抗脂质过氧化，对缺血和（或）缺氧损伤、机械损伤的神经元具有保护作用。它能减轻谷氨酸毒性，抑制血小板凝集，对抗凋亡，还能使眼动脉血流量增加。本研究结果证明EGb 761能抑制视神经横断后RGC凋亡，对RGC有保护作用，该结果与Hirooka等［11］的研究结果一致。

PERG是客观评价RGC功能的方法之一，其波形主要特征为一个正向的P50波和一个向下的N95波。根据各种疾病PERG的不同表现，Holder［12］认为两个波的起源不同。药理学分析也证明，N95波可被河豚毒素完全阻断，N95波依赖于RGC产生的动作电位。尽管P50波的确切起源还不清楚，并不能被河豚毒素阻断，但在青光眼患者和猴青光眼模型中P50波振幅均有所下降，因此推测它可能起源于RGC的胞体和（或）RGC的远端［13］。以往评价慢性高眼压引起的RGC数目减少常常采用闪光ERG［14］，然而闪光ERG只代表视网膜外层电反应，PERG才真正代表视网膜内层电反应［15， 16］。迄今，尽管对PERG的确切起源尚未完全清楚，但起源于视网膜内层是一致公认的，主要是RGC［17］。Berardi等［18］证实横断大鼠视神经后可引起RGC逆行性变性，导致PERG反应消失，而闪光ERG不受影响。目前PERG已被应用于临床评价高眼压症和青光眼患者的视功能，并认为青光眼对PERG的N95的影响比P50大［19， 20］。BenShlomo等［9］首次应用PERG评价大鼠高眼压后RGC功能，并研究N95振幅和RGC数目的相关性，结果发现两者呈正相关关系。我们的研究也证明豚鼠视神经横断后，随着RGC数目的减少N95振幅逐渐降低，且两者呈正相关关系（r=0.858 68，P=0.001 5），表明PERG的N95振幅可评价RGC数目丧失的程度。

总之，腹腔注射EGb 761可抑制视神经横断后RGC凋亡，从而保护RGC的结构和功能。PERG是评价视神经横断后RGC丧失程度的有效指标之一。

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