分子生物学进展精选(十四篇)

序言：作为思想的载体和知识的探索者，写作是一种独特的艺术，我们为您准备了不同风格的14篇分子生物学进展，期待它们能激发您的灵感。

篇1

关键词禽流感病毒;基因组;变异性;分子诊断;研究进展

中图分类号 R51 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)11-0216-02

禽流感(Avian influenza,AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的全身性或呼吸器官性传染病,国际兽疫局(OIE)把该病定为A类烈性传染病。禽流感病毒(Avian influenza vi- rus,AIV)典型的病毒粒子为球形,直径80～120nm,有时呈丝状体等多形态,至今A型流感病毒的血凝素已发现有16种,神经氨酸酶有10种。其血清型较多,容易变异。常发生在禽,有时也发生在低等哺乳类动物,至今在人仅有偶发病例。禽流感病毒根据其对鸡致病性的不同分为高致病性、中致病性和低/非致病性。禽流感病毒不仅会给养禽、畜牧业带来灾难性的破坏,而且对公共健康也构成了严重威胁。

1AIV基因组及其编码蛋白的功能

1.1AIV基因组

AIV基因组为单股负链RNA,共有8个独立的RNA节段。通过对某些毒株8个节段的测序,发现它们存在一些共同的特点,即所有基因节段的5′端前13个核苷酸均相同,3′端也有12个高度保守的核苷酸,另外在每一节段靠近5′端15～21位核苷酸处有一保守区。其序列为PolyU。这一序列可以在病毒mRNA合成时产生PolyA。

1.2病毒的蛋白

1.2.1血凝素(Hem agglutinin,HA)。HA是流感病毒囊膜纤突的主要成分之一,是基因表达产物中最大的糖蛋白,为诱生保护性免疫的主要抗原,HA在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用,刺激机体产生的中和抗体,可中和病毒的感染力,抵抗病毒的感染和发病。它是A型流感病毒毒力的主要决定因素。

1.2.2神经氨酸酶(Heuram in idase,NA)。NA由病毒核糖核酸(vRNA)片段6编码,是另一个主要的表面抗原,其成熟的形式是具有催化活性的四聚体,能将唾液酸从糖蛋白和糖脂中切开。其作用是水解细胞表面的特异性糖蛋白末端的N―乙酰基神经氨酸。避免病毒粒子的聚集,有利于病毒的释放,对病毒在感染细胞周围的扩散能力有很大影响。

1.2.3白(Nucleo protein,NP)。NP是由片段5编码的结构蛋白。主要功能是使病毒RNA(vRNA)形成核糖白复合体,以此来稳定vRNA,使其免受核糖核酸作用。另外,NP在病毒基因组的转录和复制以及决定病毒的宿主特异性方面都有重要的作用,而且它是细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原。

1.2.4基质蛋白(Matrix protein,MP)。第7节段RNA编码的蛋白被称为M1,部分分子量较小的蛋白称为M2。M1构成病毒的基质膜,具有型特异性,其抗原性的差异也是流感病毒分型的依据之一。另外,M1在子代病毒粒子的装配方面也有一定的作用。M2是一种跨膜蛋白,其作用是在HA合成过程中作为离子通道控制高尔基体内的pH值,在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境。

1.2.5聚合酶蛋白(PB1、PB2、PA)。A型流感病毒的聚合酶蛋白由PB1、PB2、PA等3种成分组成。这3种蛋白质的共同特点是含有一特异的亲核序列区,其作用是使这几种蛋白质在胞浆合成后能顺利进入细胞核。其中,PB2、PB1与合成互补RNA有关,而PA、白与病毒的RNA合成有关。

1.2.6非结构蛋白(Non-structural proteins,NS)。A型流感病毒的结构蛋白由片段8编码。片段8也有2个编码框,可编码2种蛋白质即NS1和NS2。NS1和NS2 两种非结构蛋白的编码区是基因组中最小的RN段。NS1和NS2相互间有70个氮基酸重叠,分别由不同的mRNA翻译,提示它们由不同读码框架翻译。在早期感染中NS1合成并在细胞核内积聚,磷酸化的NS1蛋白在病毒的复制过程中起调节作用;NS2主要在晚期感染中出现,并主要在胞浆中存在,目前它的功能还没有彻底搞清。

1.2.7其他蛋白质(HE、M3、NB)。由基因节段7编码,明确的功能还不清楚。

1.3AIV毒力变异的分子基础

AIV很容易发生变异,诱发AIV发生变异的主要机理有抗原性变异,即抗原漂移(Antigenic Drift)和抗原转变(Antigenic Shift)。在甲型流感病毒中,抗原漂移主要是由HA或NA基因发生点突变引起的,其中HA基因的变异率最高。每个核苷酸在每个复制周期中的变异率可高达2.0%。一般认为,来自宿主的免疫压力是HA和NA抗原漂移的主要原因。由于突变幅度较大或各节段RNA间发生的重排导致抗原性发生大转变导致新病毒亚型的产生,这种变异称为抗原转变。大量试验证明,不同亚型病毒同时感染1个细胞时,病毒基因组可发生节段间的交换。理论上讲,8个RN段存在256个不同的组合方式。事实证明,在自然界中经常有混合感染导致基因重组的事件发生。

2AIV的分子诊断

2.1血清学诊断技术

血清学诊断技术是从禽类体内采集血液析出血清后,检测血清中抗体的有无和滴度变化,如琼脂凝胶扩散试验(AGID)、细胞凝集抑制试验(HI)。AGP试验鉴定病毒或检测特异性的血清抗体或基质蛋白MP(Matrix protein)、特异性白NP。血细胞凝集试验(HA)和血细胞凝集抑制试验(HIT)鉴定病毒或血清抗体的亚型,神经氨酸酶抑制试验(NI)鉴定病毒或血清抗体亚型等。

2.2RT-PCR分子诊断技术

崔尚金等(1998)建立了一种能够直接检测禽粪和鸡胚尿囊液中H亚型禽流感病毒RNA的RT-PCR检测方法。检测过程仅需8h,不仅具有高度的敏感性和特异性,还可大大缩短对禽流感病毒的检出时间。而应用毛细管PCR(15 min,30个循环)代替常规PCR(2.5h,30个循环)进一步缩短检测时间的研究也已展开。并进入更深层次的领域,以期用于不同样品的检测,使该方法更加适用于禽流感病毒的临床早期诊断。该技术在特异地检出H或H亚型禽流感病毒同时,还可根据应用特定引物经RT-PCR扩增出的H和H包括裂解位点在内的HA基因片段。经测序推导出的氨基酸序列,判断H或H亚型禽流感病毒的致病性高低。

2.3酶免疫测定(EIA)技术

EIA技术在AI的诊断与监测方面已被广泛采用。Doller等建立了一种从鼻咽分泌物中直接检测流感病毒抗原的酶免疫方法,该方法无须对病料进行超声处理,而且在4h即可出结果。Cherian等建立了一种用于检测呼吸道分泌物中A型流感病毒RNA的PCR酶免疫(PCREIA)方法。该方法对感染后4d的病料A型AIV的检测特别有效。Schweiger等建立了用于检测A型AIVN1和N2型的DNA酶免疫(DEIA)方法。该方法简单、快速,可进行大批样品的检测。

2.4荧光PCR法

荧光RT-PCR技术是20世纪90年代末发展起来的新技术,将荧光素标记的探针与引物一起,在荧光PCR仪中反应,电脑对整个反应进行实时监测,避免了交叉污染,提高了检测敏感性,已成功用于人乙型肝炎病毒、衣原体、艾滋病病毒等的检测,根据A型禽流感病毒的共有NP基因序列设计引物、探针,建立的通用型荧光RT-PCR检测方法不仅能够用来检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型,而且对其他禽流感病毒亚型也能检出。用通用型探针、引物检测常见其他禽类病毒,未发现交叉反应。说明该方法敏感性高、特异性强。

2.5核酸探针技术

核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究应用最广泛的技术之一,是定性和定量检测特异性DNA或RNA的有力工具。用PCR技术制备了白基因片段(NPC)的地高辛标记cDNA探针,建立并优化了检测AIV的探针杂交法。该探针具有较好的特异性和敏感性,为从分子水平探讨禽流感的发病机理和临床早期快速诊断提供了新的研究手段。对以基因芯片技术为基础的检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的诊断技术进行了研究,结果表明,DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV诊断方法。

3结论

禽流感是一种全球性的烈性传染病,可在宿主中不断发生变异和基因重组,是2l世纪我国养禽业将面临的最大的瘟疫性威胁。禽流感可在禽、猪和人中进行传播。AIV不仅作为人流感的最大基因库而间接威胁人类健康,而且还可作为人类的新病毒而直接构成人类的威胁。因此,预防禽流感具有重要的公共卫生意义和经济意义。随着现代分子生物学、微生物学、免疫学等学科的发展,以及同其他学科间的渗透,禽流感的传统检测诊断技术将与现代分子生物学技术结合或者现代分子生物学技术与其他学科研究技术有机结合,一定会实现诊断的快捷、方便、准确、灵敏、经济、易操作,为禽流感的防治做出重大贡献。

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篇2

近年来，世界食管癌(esophageal cancer,EC）患者以每年30万例的速度剧增，这引起国内外的普遍关注。由于食管癌的发病在分子水平上涉及多类基因及蛋白质的作用，故分子生物学研究对其早期诊断、治疗及预防等有重要意义。本文拟就近年食管癌的分子生物学研究进展做简要的综述。

1 生长因子基因

1.1 表皮生长因子受体EGFR：表皮生长因子受体EGFR是分子量170KD的跨膜酪氨酸激酶糖蛋白，由原癌基因erb-4编码而成，与其配体EGF或TGF-a结合可激活受体本身的酪氨酸蛋白激酶活性，从而激活信号传导系统，刺激细胞生长增殖。erbB-1（EGFR）、erbB-2(HER2)erbB-3和erbB-4共同构成表皮生长因子家族，它们都属于酪氨酸激酶受体。临床上在多个食管鳞癌（ESCC）细胞系及ESCC肿瘤的标本中，都发现过EGFR的过表达。C-erbB-2编码蛋白p185与细胞伪足结合，能加速细胞运动，从而促进癌细胞浸润与转移。日本、美国和法国的研究资料表明，食管腺癌（EADC）EGFR基因扩增率较高（30.8%），并出现EGFR和C-erbB-2基因共扩增[1]，ESCC EGFR基因扩增率则为8%～30%，且C-erbB-2没有扩增。由此，研究EGFR和C-erbB-2可能与食管癌的发生有关，且EGFR可能存在地区和种族差异性。同时，通过对食管癌前病变的研究，发现EGFR蛋白过度表达在食管基底细胞过度增生和间变的发生率分别为39%和80%，而在正常食管黏膜上皮则未见该蛋白过度表达，因此提示EGFR与EC癌前病变的发生、发展密切相关。

1.2 血管内皮生长因子VEGF：在调节控制血管生长的过程中，血管内皮生长因子VEGF显得尤为重要。实验室中对五个EC细胞系进行RT，PCR技术分析，发现其中有四个细胞系存在VEGF-C mRNA表达。医学研究表明，约占20%～70%的EC有VEGF的表达，并且与肿瘤分明、静脉侵入、EC浸润深度、淋巴细胞浸润及淋巴结转移有相关。

2 细胞周期调节基因

2.1 p53基因：p53是一种核转录因子，是定位于17p13.1上的肿瘤抑制基因，在机体环境受到和缺氧、DNA损伤或氧化还原紊乱等刺激时，它可以通过磷酸化和乙酰化作用被激活。p53基因通过p21介导对细胞周期进行调控，并且通过上调Bax的同时下凋Bbcl-2来诱导凋亡。p53基因的异常与食管黏膜细胞癌变的过程密切相关，大多数点突变发生在外显子5～8之间。Simeda等[2]研究提示，在EC的形成中，p53的基因突变和蛋白产物的聚积先于肿瘤的浸润，是食管癌发生过程中一个较早期事件。

同时，研究表明，肿瘤抑制基因p53的突变常伴有pRb的改变。通过对病毒原癌蛋白的研究，提示肿瘤抑制基因pRb和p53有联合作用，病毒原癌蛋白能使两种分子失活。细胞在一种肿瘤抑制基因异变时,细胞分裂的加快会加强基因的不稳定性,并进一步导致细胞增生调控紊乱,克隆生长加快,直至形成肿瘤。因此，p53-Rb系统的改变，特别是其对细胞增生的凋亡调节协同作用紊乱，可能是食管癌变的重要分子机制[3]。

2.2 pRb基因：Rb基因位于染色体13p14上，具有多个被磷酸化的位点，是多种cyclin-CDK的底物。Rb蛋白通过与E2F的结合，有效抑制细胞增生。Cyclin-CDK复合物可使pRb发生磷酸化，从而释放E2F以促进基因转录与细胞分裂。在多种肿瘤及肿瘤细胞系中，都可发现pRb基因的缺失或突变，ESCC中，Rb位点LOH在pRb基因的失活中起重要作用。Maesawa等用PCR检测了49例食管癌Rb位点LOH在pRb基因的失活中起重要作用。Maesawa等用PCR检测了49例食管癌Rb基因的杂合性丢失（LOH），其LOH的发生率为52%（13/25）。食管小细胞中未观察到pRb的表达，提示缺乏pRb表达可能在食管小细胞癌中起重要作用。

2.3 p16和p15基因：在细胞周期G1期调控细胞增生，录属INK4I即cy-clin-dependent kinase 4 inhibitors家族。由于p16和p15基因同时失活可引起pRb调控的R点（restriction point,G1/S检验点）的丧失，因此肿瘤细胞发生恶性增生很有可能与p16和p15的失活有关系。在ESCC细胞系中55%细胞系显示p16,p15和（或）9p21相邻位点有纯合性缺失。在ESCC标本的研究中发现p16失活占优势作用的是启动子区CpG岛异常甲基化，突变和纯合缺失相对很低，而p15常发生纯合缺失[4]。

2.4 Cyclin D1基因：Cyclin D1位于11q13号染色体上，为正调控因子。细胞周期是由CDKs及其亚调节单位cyclins序贯性激活调节的，通过cyclin D1蛋白来影响CDK介导的Rb磷酸化而促进G期细胞的进程，因此cyclin D1蛋白是G1期细胞增殖信号的关键蛋白。

Roncallii等发现在食管鳞状细胞癌中，Cyclin D1和Rb蛋白的积聚间，以及p16表达的缺失和Cyclin D1过度表达间均存在正相关有关系。Cyclin D1在EADC几乎无扩增，而其扩增与ESCC有明显的相关性[5]。

3 抑制细胞凋亡基因

3.1 Bc1-2基因：Bc1-2基因属抑制细胞凋亡基因，其位于染色体18q21，在正常食管黏膜中不过度表达。研究表明，Bc1-2基因在ESCC和癌旁非典型增生组织中表达增高，另外还发现Bc1-2基因表达与肿瘤分化程度有关，肿瘤分化程度越高，Bc-2基因阳性表达率也越高。

3.2 survivin基因：survivin基因属凋亡抑制基因，其蛋白质表达与肿瘤的发生、发展及预后有关，在食管癌相关研究中发现，依正常黏膜――单纯增生――不典型增生原位癌――浸润癌的顺序，survivin蛋白表达的阳性率依次增高[6]。据此推测，survivin的表达可能与细胞生物学转化的中间环节有关，因而可作为食管癌早期诊断的参考。在形态学中若正常及增生黏膜上皮survivin呈阳性表达时，正常组织中可能存在癌变的可能。在高分化鳞癌中，survivin蛋白表达低于低分化鳞癌中的表达，有淋巴结转移组survivin蛋白表达高于无淋巴结转移组，据此推测survivin可抑制食管癌细胞自身的凋亡过程，使肿瘤细胞出现无限制生长。

4 代谢酶基因和DNA错配修复酶基因

4.1 代谢酶基因：研究发现，个体对胃肠道肿瘤的易感性可能与前致癌物的激活及解毒间的代谢失衡有关：化学致癌物中，绝大多数为前致癌物，其致癌性需通过Phase-1酶的激化才可发生作用，而活化的致癌物可被Ph-Ⅱ酶解毒。在对高加索人的研究中发现，GST第313位核苷酸的碱基替换更常出现于Barrett食管患者和腺癌患者，提示GST可能与个体对Barrett食管和食管腺癌的易感性有关[7]。而对日本人的研究表明，同时有GST基因和NA12基因者患食管鳞癌的风险增加，GST和NAT2的多态性可能作为一种预示着对食管鳞癌易感性的遗传生物标记[8]。另外，研究表明细胞色素P450（CYP）基因对许多小分子化合物起氧化作用。Nimura等[9]的研究表明具有CYP基因型的重度吸烟者是食管癌高危人群。Lin等[10]报道中国林县地区人群的CYP2E1基因Rsal识别的CI基因型频率在食管癌、食管癌前病变组织比正常对照组高。

4.2 DNA错配修复酶基因：由于不同的个体DNA修复能力也存在着一定的差异，而基因组的不稳定性在很大程度上与个体机能缺乏修复DNA的能力有关。DNA修复能力差的个体突变率高，肿瘤的易感性也相应会有所增强。Wang等对中国北部食管癌高发区的70个食管癌组织及6个食管癌高危家庭成员进行的分析研究，发现其淋巴细胞的遗传呈多态性，其中7个食管癌标本的MGMT中8个密码子内10WH 点突变，而在其邻近的正常组织未检测到这些突变。O6-甲基鸟嘌呤-甲基转移酶（O6-methylguanine-methyltrans-ferase,MGMT）可以修复DNA烷基化试剂引起的突变，分析表明MGMT基因的突变或缺失可能是导致DNA高突变率原因之一[11]。

在外界环境中，有很多致癌原如亚硝胺等。这些致癌原多为烷基化合物，O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶（O6-alkylguanine-DNA alkyhransferase,AGT），是重要的DNA损伤修复酶，外界环境中的许多致癌原，包括亚硝胺，许多是可诱导DNA形成O6-烷基鸟嘌呤加成物的烷基化合物。而在保护细胞免受烷基化学物质诱导的突变和细胞毒侵袭等方面，AGT酶起着重要作用。人的AGT基因共包含5个外显子以及170多个Kb。AGT基因的编码序列开始于第二外显子，其活性位置是第五外显子145位密码的半胱氨酸。目前的研究表明，人的AGT基因呈现多态性。当烷基化学物质诱导产生DNA突变前损伤产物O6-烷基鸟嘌呤而又未得到AGT酶的及时修复时，将促使DNA复制时发生碱基转换，从而增加对肿瘤的易感性，诱导肿瘤形成。实验已证实在河南食管癌高发区人群中，存在AGT第三外显子84位和第五外显子第143/178位密码子多态变体L2，但AGT多态变化与食管癌高易感性的关系尚待进一步研究。

5 食管癌变分子学基础研究的临床应用

近年来，对食管癌分子生物学研究表明，食管癌是多种相关或独立的基因或分子改变的多阶段进行性演变过程，是多种基因变化累积或综合作用的结果。在医学研究中，必须积极寻找、研究食管癌早期基因，并通过分子生物学的基础研究来实现食管癌的早期诊疗和临床应用，这主要包括三个方面：一是根据分子生物学基础研究，及时对高危人群进行检测，从而选出简易、经济、特异性和敏感性高的，作为监测所用的生物学指标；二是通过分子生物学研究，有效提示食管癌的致病因素，以实施有效的食管癌病前预防、干预措施；三是充分利用分子生物学研究结果，为食管癌患者提供早期诊断指标和特异性的生物治疗方法，如基因治疗法等。

篇3

Abstract: The animal protects own one driving way to ambient temperature's adaptation, displays in the duplication and the expression pattern change of the cell and presents the new gene open and the new protein factor synthesis. The gene level, the protein level, the cell membrane level and so on three aspects has carried on the summary about the research survey of animal which adapts to the ambient temperature, and discussed the molecular biology mechanism as well as in evolution significance which animal adapts to the ambient temperature.

关键词： 动物；温度；基因；蛋白质；细胞膜

Key words: animal；temperature；gene；protein；cell membrane

中图分类号：Q291文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2011）25-0324-02

0 引言

动物的一切生命活动（生长、发育和生殖等）都是在一定的环境温度中进行的。一般说来，变温动物生长发育所要求的温度条件在 6-36℃范围内；恒温动物由于自身有调节体温的能力，对环境温度的适应范围广些[1]。当环境温度在最低和最适温度之间时，动物体内的生理生化反应会随着温度的升高而加快，代谢活动加强，从而加快生长发育速度；当温度高于最适温度后，参与生理生化反应的酶系统受到影响，代谢活动受阻，势必影响到动物正常的生长发育。环境温度若超出动物所要求的范围，动物的生命活动就会出现停滞；温度过高或过低会导致动物体死亡[2]。近年来关于动物对外界环境温度适应的分子生物学研究主要集中在基因水平、蛋白质水平和细胞膜水平三个方面。

1 基因水平上的温度

动物对环境温度的适应，会使自身的细胞内转录和表达模式发成变化，以适合环境的变化，此时它会出现新的基因开放和新蛋白因子的合成，这总的来说是动物对自身的一种保护方式。

外界环境温度的改变可以诱导动物体内热激蛋白家族基因的大量表达，从而调整动物有机体对外界环境温度的适应。

尽管热激蛋白家族基因序列保守，编码序列变异较低，但是，由于目前动物种类逐渐增多，热激蛋白基因序列和拷贝数等也在逐步显示出不同的趋势。

适应不同温度的果蝇居群，其热激蛋白70基因内存在两个显著的差异[4]，一个大的插入/缺失（indel）多态位点（56H8/122）和一个单核苷酸多态位点差异；对于来自澳大利亚东部不同纬度的11个居群，插入/缺失位点的频率与纬度呈正相关，由于纬度与温度最大（小）值和平均值呈负相关，提示温度和热值变化可能对Hsp70基因的这一变异频率产生了影响，Anderson[5]等也发现黑腹果蝇3号染色体右臂上hsr-omega基因的8bp缺失作为一个遗传标记与纬度及最高温（最热月）呈正相关，另一个3端重复的标记则多出现于温带群体中，与冷适应性相关。适应于较低纬度的Drosophila lummei有7个Hsp70基因拷贝，其热胁迫抗性高于具有5个拷贝的Drosophila lummei，后者在分布上处于较高的纬度，提示Hsp70基因结构与果蝇的适应纬度有相关性[6]。

果蝇体内一个名为“DmDG”的基因活性一旦下降，果蝇就会“怕热”，从而喜欢向温度更低的地方转移，其喜好的环境温度要比正常情况下低5摄氏度[7]。“DmDG”基因可能与果蝇的代谢功能相关。这个基因活性下降后，果蝇体内能量代谢就会活跃，于是就会更喜欢低温环境。动物体内利用基因调节温度适应性的机制普遍存在，这可以使动物适应很大的温度变化。

克隆斑潜蝇（Liriomyza sativae）3种小分子Hsp（Hsp19.5、Hsp20.8和Hsp21.7）和2种Hsp60（TCP1α，TCP1ζ），定量PCR分析表明，3种小分子Hsp均能被低温所诱导表达，而且Hsp20.8对低温更敏感，这意味着不同的小分子Hsp可能响应不同强度的低温胁迫。6种Hsp基因（Hsp19.5、Hsp20.8、Hsp21.7、TCP1α、TCP1ζ和Hsp90）的相对表达量在不同生长发育阶段差异显著。总的表达趋势是：小分子Hsp（Hsp19.5、Hsp20.8、Hsp21.7）在蛹期表达量最高，而大分子Hsp（TCP1α、TCP1ζ、Hsp90）的表达量则随着生长发育而递增[8]。这意味着除响应温度胁迫外，热激蛋白基因可能还在昆虫的生长发育中起着一定的作用。

2 蛋白质水平上的温度适应

热激蛋白（Hsps）是生物适应环境温度变化的一个重要媒介分子。受到热胁迫刺激后，动物有机体对热的胁迫抗性提高与热激蛋白表达量普遍成正相关[9]。

热激蛋白存在于所有动物细胞中，是动物受到应激原刺激后诱导产生的一组应激蛋白，与机体的应激关系密切，在进化上高度保守。对滞育的吉普赛蛾（Lymantria dispar）幼虫给以37-41℃的热激可以诱发合成7种Hsps（分子量分别为90，75，73，60，42，29和22ku），-10--20℃的冷休克导致其产生2种Hsps（90和75ku），当在25℃下恢复时另外又合成分子量29ku的热激蛋白[10]。斑马鱼在热胁迫（28-37℃）和冷胁迫（20-28℃）下的热激蛋白表达模式存在差异，在热胁迫条件下，Hsp70呈上调表达，而冷胁迫下Hsp70则显稳定表达[11]。将新月鱼的成纤维细胞系的培养温度从28℃调节到37℃时诱导产生3种不同的热休克蛋白[12]。

较缓和的高温对B型烟粉虱Hsp70表达具有诱导作用，极端高温会抑制Hsp70表达。在37-41℃范围内，Hsp70的表达量随着温度的升高而升高，在41℃时达到最高峰；当温度升高到43℃和45℃，B型烟粉虱Hsp70的表达量迅速降低。B型烟粉虱温室种群体内的Hsp70表达量与温室内的温度有关：上午到中午随着气温的升高，B型烟粉虱体内Hsp70表达量随之上升；傍晚气温降低时，Hsp70表达量也随之下降[13]。Kimura（1998）比较过3个果蝇近缘种热休克蛋白基因的表达情况，发现在冷激条件下，亚热带低海拔种（Drosophila watanabe）诱导热休克蛋白表达的阈温度要比温带种（D．traurara）和亚热带高海拔种（D．trapezifrons）高，而亚热带低海拔种的耐寒性却最低，说明在果蝇中热休克蛋白基因表达和耐寒性呈负相关[14]。Sorensen et al（2001）研究果蝇（D．huzzatii）不同自然种群间HSP70基因表达后，发现在冷激下寒温带种群诱导热休克蛋白基因表达的阈温度要明显低于热带种群[15]。

3 细胞膜水平上的温度适应

在正常生理温度下，细胞膜的主动运输、酶的活性、胞外分泌等机能才能正常进行[16]。细胞的膜脂在不同温度下具有不同的酰基链和链长度[16]。细胞膜化学成分改变可能是对温度适应的最普遍模式[16]。低温通过影响细胞膜的流动性而影响细胞正常的机能，对低温的适应不可避免地会涉及到细胞膜化学成分的改变。胆固醇能够促使细胞膜结构的有序化，从而增加细胞膜的流动性。鱼类通过改变脂肪酸中不饱和成分含量和极性磷脂头部组分，减少细胞膜中甾醇/磷脂比率来改变膜的流动性使鱼类更加适应寒冷的外界环境[17]。通过对不同温度适应下虹鳟鱼（rainbow trout）的肝、肾、腮等组织细胞细胞膜中胆固醇（C）与磷脂（P）含量的研究发现，5℃适应组细胞膜的C/P 值显著低于20℃适应组[3]。把鱼体暴露于低温下会导致的极性磷脂中非饱和脂肪酸/饱和脂肪酸比例增高，有利于在低温下维持细胞膜流动性，使鱼体更能抵抗低温损害[18]。低温还诱导细胞脂肪酸氧化酶的生成，由于它可以提高细胞膜中不饱和脂肪酸的含量，从而提高了细胞膜在低温条件下的流动性[19]。

在动物对温度的适应过程中，动物细胞还通过膜上各种离子通道数量及分布的改变使细胞内离子的成分和浓度发生相应的改变。研究表明，在北极生活的两种鱼类：Trematomus bernacchii和Trematomus newnesi在适应较高温度过程中，腮和肾等渗透压调节器官细胞膜上的Na/K+-ATP酶活性升高，将细胞内钠的、氯离子快速泵出体外，从而使得血清中渗透压明显降低，与海水间的渗透压差增大。研究结果表明，在冷环境中，鱼类靠升高体液离子浓度及渗透压来缩小与外界海水之间的差异，从而减少能量损耗[3]。鸭子对冷适应表现为肌浆网或内质网上Ca2+-ATPase活性及Ca2+释放通道数量上的改变时相与非寒颤产热的发生相一致[20]。

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篇4

与临床病理学相比，肿瘤分子生物学标记为肿瘤生物学行为的分析、治疗方式的选择、临床预后的判断提供了更客观、更丰富的信息，全文就目前国内外对膀胱移行细胞癌分子生物学标记物的研究概况作一综述。

【关键词】 膀胱移行细胞癌　标志物　分子生物学　免疫学

膀胱移行细胞癌（TCC）的主要特征有多中心性和易复发性，肿瘤细胞易于种植转移，临床上仅根据肿瘤病理判断预后较为困难。鉴于此，目前对其分子生物学标记物的研究愈来愈多，如p53、p21、Ki67、bcl?鄄2等。已有多篇文献报道分析了相关分子生物学标记物与泌尿系统上皮肿瘤的病理分级、临床分期、复发及生存率的关系，为诊断肿瘤、制定正确的治疗方案及判断预后等提供重要的信息，本文就目前已报道的分子生物学标记物作一综述。

1　癌基因与抑癌基因

1.1　p53

p53的突变或丢失在膀胱癌的检出率为50％～60％，Migaldi等[1]分析不同年龄膀胱癌患者的p53表达，发现p53异常表达在小于45岁的膀胱癌患者更为常见。大量研究表明，p53的改变与膀胱癌的分期、分级、侵袭性有关，但其是否与膀胱癌的复发及生存率相关仍有争议。Yeniyol等[2]采用免疫组化检测48例膀胱移行细胞癌标本中p53的表达，p53异常表达在不同临床分期和病理分级间差异显著，但未发现p53阳性组与阴性组肿瘤复发率和死亡率有明显差异。Stavropoulos（n＝58）和Ong（n＝64）等[3]也得出类似的结论。但另有多篇文献报道，p53与膀胱癌的复发率和死亡率显著相关。Sanchez等[4]报道复发的膀胱癌（n＝47）p53的异常表达明显高于未复发者，p53的异常表达与膀胱癌的进展和生存率相关。Wolf等报道p53异常表达与pT1G3膀胱癌（n＝30）的预后关系密切。

p53突变可能与膀胱原位癌（CIS）的生物学行为有关，导致CIS的侵袭性增加，Shariat等[5]检测47例膀胱CIS的p53及其中39例标本的p21表达，p53/p21联合分析显示出与肿瘤的复发、进展及生存率之间密切的相关性，p53（+）/p21（+）患者肿瘤复发进展和死亡的危险程度远大于p53（+）/p21（-）或p53（－）/p21（－）者。

1.2　p21

关于p21与膀胱癌的报道结果并不统一，Chatterjee等[6]检测p53、p21、pRb在164例TCC标本中的表达，结果显示p53、p21、pRb可作为判断TCC复发率和5年生存率的独立因子，三者联合分析显示出与TCC预后之间良好的相关性。Kuczyk MA等也认为p21WAF/CIP1可以作为判断膀胱癌生存率的独立预后因子。Liukkonen等[7]检测207例膀胱癌(pTa～pT1)标本中p21WAF1/CIP1和细胞周期素D1的表达，平均随访4.9年，分析其与肿瘤分期、分级、细胞增殖率（MIB?鄄1指数）、p53、bcl?鄄2、生存率的关系。结果只有MIB?鄄1指数与无瘤生存率显著相关（P=0.03），肿瘤复发率只与肿瘤分级（P=0.002）和细胞周期素D1的表达相关（P=0.04），提示p21WAF1/CIP1与其他因子相比预后作用较小，有关p21WAF1/CIP1在判断膀胱癌预后中的意义有待进一步阐明。

1.3　p16 /CDKN2A

Hitchings等[8]检测78例TCC 标本（pTa～pT1） p53、p16、pRb的表达，多因素分析显示任何两者的改变与肿瘤的进展密切相关，p53和 p16同时表达异常者肿瘤的进展可能性增加14.45 倍，提示p53和 p16可用来判断pTa～pT1期膀胱肿瘤的进展情况。Benedict等发现肿瘤标本中p16/CDKN2A的表达与Rb的表达呈负相关，Rb强染色的标本罕见p16阳性染色，同时，伴染色体9p21的杂合丢失的肿瘤p16/CDKN2A失表达，Rb强表达。Primdahl等发现初诊即为浸润型膀胱癌p16/CDKN2A的表达显著低于继发于Ta 或T1的浸润期肿瘤，有关进一步解释尚待研究。

1.4　Rb

Sanchez Zalabardo D等[4]随访47例浸润型膀胱癌患者，发现Rb表达异常的患者肿瘤进展速度、复发率显著升高。Sunanda等检测164例TCC标本pRb的表达，得出结论pRb可作为判断TCC复发和生存率的独立预后因子。另有报道对45例T1期膀胱肿瘤患者随访发现Rb基因的丢失与pRb的异常表达明显导致患者无瘤生存率降低，此外，多篇文献报道Rb在与p21、p16、Ki67、p53等联合判断膀胱癌预后时表现出良好的相关性，可作为较理想预后因子。

2　细胞增殖相关指标

细胞核相关抗原（Ki67）是增殖性细胞核的标记物，可通过单克隆抗体MIB?鄄1检测，其在判断膀胱癌预后中的重要意义被越来越多的作者证实。Migaldi等发现老年患者膀胱癌标本MIB?鄄1指数高于年轻者，并且与膀胱癌复发率、生存率密切相关[9]。Nakopoulou等(n=94)、Saika等（n=203）、Santos等（n＝159）也研究发现Ki67是膀胱癌良好的独立预后因子。

Frank等[10]选取伴区域淋巴结转移的尿道膀胱肿瘤139例，手术切除肿瘤并行化疗，随访分析p53和MIB?鄄1在判断肿瘤预后及化疗疗效中的作用，结果并未发现p53和MIB?鄄1与该类肿瘤患者的预后具有显著性相关，但MIB?鄄1指数与肿瘤的化疗疗效呈显著负相关，提示MIB?鄄1可以作为判断膀胱癌化疗疗效的指标，指导临床治疗。同样，Matsumoto等对62例膀胱移行细胞癌（pT1G3～pT4M0）标本进行类似研究，平均随访34个月，发现Ki67的表达与肿瘤化疗完全缓解率显著性相关，能较好地判断疗效。

3　细胞凋亡相关指标

3.1　bcl?鄄2/bax

bcl?鄄2被认为是抑制细胞凋亡的重要的原癌基因。bcl?鄄2、bax属于凋亡调控基因bcl?鄄2 基因家族， 分别能够阻遏和促进凋亡， bax?鄄bax同源二聚体促进凋亡，bcl?鄄2?鄄bax异聚体阻遏凋亡，突变的p53蛋白可起到与bcl?鄄2蛋白类似的作用，并抑制bax基因的转录，进而抑制凋亡。

Uchida T等观察到119例膀胱癌患者中p53的表达与肿瘤分期分级相关，bcl?鄄2表达与肿瘤临床病理特征无关，但p53和bcl?鄄2同时过表达提示不良预后[11]。Wolf、Gazzaniga等也证实bcl?鄄2的表达与肿瘤复发率和无瘤生存率明显相关。但 Asci R等[12]报道年龄小于40岁患者TCC细胞浆bcl?鄄2和p53的表达分别为54%、37%，与肿瘤的进展无明显相关。同样，Fraile、Stavropoulos等报道bcl?鄄2的表达与膀胱癌的分期、分级及复发率无明显相关，提示有关bcl?鄄2的作用仍需进一步研究。

3.2　Fas/FasL

Fas与FasL都是跨膜蛋白，分别属于TNF受体和TNF家族，T淋巴细胞和NK细胞的活化可导致细胞表面FasL被激活，与Fas结合，使表达Fas的细胞发生凋亡。Lee SH等检测37例膀胱癌标本，Fas/FasL的高表达达到92％。Lee等报道43例膀胱肿瘤标本28％有Fas基因的突变。目前对血液中可溶性Fas (sFas)和可溶性FasL (sFasL)研究较多，Mizutani等[13]报道sFas或sFasL的升高预示Ta期膀胱癌患者早期复发的可能，sFas或sFasL可作为判断Ta期膀胱癌复况的预后因子。

4　血管形成因子

4.1　VEGF

与大多数实体瘤一样，膀胱癌的形成也具有血管形成依赖性，与血管内皮生长因子VEGF关系密切。Vasilios等[14]研究VEGF和低氧诱导因子(HIF?鄄1α)之间的关系及两者在TCC中的预后意义，结果显示HIF?鄄1α与肿瘤病理分级显著相关，VEGF和微血管密度（MVD）与肿瘤分级和临床分期显著相关。HIF?鄄1α与VEGF和MVD显著相关，提示VEGF和HIF?鄄1α的升高刺激血管生成，导致肿瘤预后不良。同样，Santos（n＝66）也报道VEGF可作为判断膀胱上皮肿瘤的预后因子。

4.2　血栓黏合素?鄄1

血栓黏合素?鄄1(TSP?鄄1) 是细胞外基质中的一种糖蛋白，分子量为430kD。TSP?鄄1被认为是惟一抑制肿瘤血管形成的物质。Grossfeld等[15]分析了163例TCC标本TSP?鄄1、p53的表达与TCC复发生存率之间的关系，TSP?鄄1表达与TCC复发 （P=0.009）和生存率（P=0.023) 显著相关，低表达TSP?鄄1患者肿瘤复发率增高，生存率降低。

5　生长因子及受体

5.1　EGFR

EGFR在众多上皮肿瘤中有较高的阳性表达，Colquhoun等[16]综述了近年来有关EGFR与膀胱癌的研究，得出结论EGFR的表达与膀胱癌的分期、分级、复发率、无瘤生存率明显相关，EGFR过表达提示肿瘤预后不佳，使用抑制EGFR活性的物质如ZD 1839等可望成为临床治疗膀胱癌等的新手段。

5.2　TGFα

TGFα在膀胱癌中的表达显著高于正常膀胱组织，Ravery等报道43例膀胱癌中60％存在TGFα高表达，且与肿瘤死亡率显著相关。Ravery等分析28例早期膀胱肿瘤TGFα?鄄mRNA的表达，随访两年发现其与肿瘤复发显著相关，对判断早期膀胱肿瘤的预后有重要价值。Thogersen等则报道TGFα与EGFR的表达相关，但与患者生存率无明显相关，其在判断膀胱癌预后中的作用有待研究。

6　细胞外基质与细胞黏附分子

6.1　MMPs

Hara等[17]分析51例表浅TCC中MMP?鄄2、MMP?鄄9、膜型MMP?鄄1 (MT1?鄄MMP)与肿瘤复发率间的关系，复发组MMP?鄄9的表达是未复发组的2.5倍，未发现MMP?鄄2、MT1?鄄MMP表达的差异，MMP?鄄9高表达组无瘤生存率显著低于正常表达组。同样，Ozdemir等检测60例膀胱癌MMP?鄄1，MMP?鄄2，MMP?鄄9的表达，发现只有MMP?鄄9的表达与肿瘤的分期分级相关。Papathoma等报道随着尿路上皮肿瘤分级和浸润程度的升高，MMP?鄄9和MMP?鄄2表达显著升高，但两者与肿瘤的复发率无明显相关，提示其在判断膀胱癌转移和预后中的意义仍有待研究。

6.2　E?鄄钙黏蛋白

E?鄄钙黏蛋白的表达与肿瘤分化、癌细胞侵袭能力及转移可能相关。Shahrokh等检测53例膀胱CIS标本E?鄄钙黏蛋白的表达，随访131个月，多因素分析表明E?鄄钙黏蛋白是与CIS复发、进展、无瘤生存率显著相关的独立因素，提示E?鄄钙黏蛋白异常表达的肿瘤侵袭性高，需要早期彻底治疗。Rao等分析细胞支架蛋白－肌动蛋白（Gelsolin）和E?鄄钙黏蛋白在判断膀胱癌预后中的意义，结果示Gelsolin与膀胱癌进展和复发密切相关，但未发现E?鄄钙黏蛋白在判断膀胱癌预后中的显著意义，其在判断膀胱癌预后中的意义还有待明确。

与临床病理学相比，肿瘤分子生物学标记为肿瘤生物学行为的分析、治疗方式的选择、临床预后的判断提供了更客观、更丰富的信息，深入研究此类标记十分必要。目前对泌尿系统上皮肿瘤分子生物学标记物的研究虽已取得进展，但除了对个别标记物Rb、Ki67的意见较为统一外，对绝大多数标记物在肿瘤中的表达分布及预后价值仍存在争议，目前的文献报道多存在样本量小的问题，缺少大规模研究的支持，再加上免疫组化法检测蛋白受抗体选择、阳性结果判断、手工操作等外在因素影响的问题，导致研究结果之间缺乏可比性或对同类研究对象得出相反的结论，因此需要将实验方法标准化以提高研究的可靠性和可重复性。此外，由于肿瘤的进展和转移是涉及多种分子机制的极其复杂的过程，仅凭对单一预后指标的评估不能全面准确地反映肿瘤的恶性潜能，肿瘤免疫标记物最终的临床应用可能是多个指标的综合评估。

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篇5

[关键词] 分化型甲状腺癌；分子生物学；进展

[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）09（b）-0019-03

甲状腺癌主要组织病理学类型包括状癌（PTC）、滤泡状癌（FTC）、髓样癌（MTC）以及未分化癌（ATC）。前两者统称分化型甲状腺癌（DTC），共占甲状腺癌的90%以上，占头颈部恶性肿瘤的首位，占所有恶性肿瘤的3%，女性发病率较高。近20年来，我国甲状腺癌发病率呈明显上升趋势，由约1/10万上升到（3～4）/10万。DTC确切的致病因素尚不清楚，幼年时过量射线照射是目前唯一确定的致癌机制[1-2]。近年来分子生物学技术研究使人们对甲状腺癌的分子机制有了更深入的了解，这对于指导甲状腺癌的诊断治疗及疗效评价有非常重要的意义，本文就DTC相关基因研究进展进行综述。

1 BRAF基因

BRAF基因最早是在人类尤文肉瘤中发现的高度表达变异的癌基因，在极少数的胃肠癌、肺癌、卵巢癌以及甲状腺癌等多种肿瘤中都有表达[3]。BRAF又名鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，该基因位于第7号染色体，为RAF基因家族成员之一，是RET和RAS的下游信号分子。目前认为，BRAF基因突变是甲状腺癌最常见的基因变异之一，约49%的PTC和25%的ATC会出现该基因的表达[4]。其发生机制为BRAF基因错义突变的15外显子碱基，致使翻译蛋白质600位密码子将对应的缬氨酸 （V600E）替代为谷氨酸，可活化蛋白激酶，并进一步激活ERK激酶，向MAPK信号通路下游传递细胞有丝分裂信号，致使甲状腺细胞肿瘤形成并向恶性转化[5]。

BRAF基因突变是近年来甲状腺癌基因领域的重要研究进展，也是目前针对DTC发生机制研究最多的突变类型之一。最近研究显示导致激酶激活突变的因素有多种，包括点突变框内插入或框内缺失、放射线暴露等，尽管其发生率较低。由于BRAF基因突变在DTC中发生率较高，而在甲状腺良性病变中检测不到，因此该突变可以作为特异性较强的DTC诊断指标。该突变与低分化的甲状腺癌及ATC的变异性也有较强关联性，在高细胞及经典亚型的PTC中更为常见。还有研究显示该突变的存在似乎与肿瘤的侵袭性特征有关，此突变可使肿瘤更易去分化，因为此突变可见于间变性转化，如甲状腺包膜外侵犯、远处转移和肿瘤复发，而这类因素往往代表着较高的肿瘤相关死亡率。一些大样本临床研究证实，腺体外浸润、区域淋巴结转移、TNM分期（Ⅲ/Ⅳ期）均与BRAF突变呈正相关[6]。有研究对PTC患者随访显示高达80%～85%的复发PTC伴有BRAF突变，这证明对于PTC复发，BRAF突变有很强的预测作用。

以BRAF以及其下游激酶为靶点的分子靶向药物治疗已成为目前DTC治疗研究的又一热点。近年来研究显示多靶点激酶抑制剂索拉非尼（sorafenib）能抑制BRAF突变基因型的甲状腺肿瘤细胞和甲癌肿瘤模型的增殖和生长，但目前国内尚未见该药用于甲状腺癌治疗的报道[7]。

2 RET/PTC重排基因

RET基因于1985年首次发现于小鼠转化的NIH3T3细胞中，因其同样具有与其他基因重排及活化的特征，故又称为RET原癌基因。RET原癌基因经重排后被称为RET/PTC癌基因，属于酪氨酸蛋白激酶受体家族。在这些RET/PTC重排中，RET基因的跨膜区和细胞外区丢失，取而代之的是不同基因来源的5′末端，例如RET与H4融合形成RET/PTC1嵌合体，与RIalpha融合形成RET/PTC2嵌合体等。其产生的嵌合体使RET原癌基因编码的酪氨酸蛋白激酶发生激活，通过下游信号的传导使甲状腺滤泡上皮细胞发生恶性转化[8]。目前研究指出，甲状腺的免疫功能通过RET/PTC1下调，可间接促进PTC的发生。提示癌基因、免疫、炎症及恶性肿瘤生物学特性之间存在一定联系，在甲状腺癌发病机制中RET/PTC基因重排有较重要的作用。

在PTC细胞中RET/PTC基因重排普遍存在，而在正常甲状腺组织及良性甲状腺病变中不表达或基本不表达[9]，所以RET/PTC重排可以作为诊断PTC较特异的指标。但PTC中RET/PTC的表达率报道不一，所以其阴性结果并不能完全除外PTC。此外，国外研究还发现放射性暴露史能引起RET/PTC基因重排并进一步促使甲状腺癌的发生。国外学者报道幼年时曾有放射线暴露史的PTC患者的RET/PTC重排发生率明显高于无此经历的PTC患者[10]。还有作者对在切尔诺贝利核泄露事故中受过量射线照射所致的状甲状腺癌患者进行分子生物学分析也发现上述特点。

对于有无RET/PTC重排及与PTC的临床特征之间的关系，目前临床认为存在RET/PTC重排的PTC患者的TNM分期更晚，也更易表现出甲状腺被膜外侵犯，也更易复发。但由于采集病例数较少以及所采用的免疫方法不同，在不同的国家和地区，其阳性率相差也比较大，为2.5%～53.5%。还有证据显示是否存在RET/PTC重排与甲状腺状癌的不同生物学行为特点有关，有RET/PTC2重排的分化型甲状腺癌往往具有高度的侵袭性和去分化能力[11]。国外Zafon等[12]报道 RET/PTC表达阳性的甲状腺状癌患者更易发生局部浸润及淋巴结转移，两者差异有统计学意义（P

舒尼替尼（sunitinib）为近年研制的一种多靶点受体拮抗剂，可以明显抑制RET/PTC酪氨酸激酶[13]。在另一项研究中，舒尼替尼可抑制具有RET/PTC1重组的PTC增殖和生长，但目前国内亦尚未用于甲状腺癌的临床治疗。

3 RAS原癌基因

RAS是一种原癌基因，广泛存在于人和动物细胞中，为人类多种肿瘤最常见的基因异常。RAS基因包括K-RAS、H-RAS和N-RAS 3种类型，这三种基因内结构分别很大，但都编码一种结构相似的G蛋白质，分子量为21 kD，故统称为P21-RAS[14]。分子生物学及遗传学研究提示，RAS基因是存在于细胞膜上一种鸟嘌呤核苷酸的结合蛋白，为多种酪氨酸激酶受体的感受器，并细胞的生长及分化起调解作用。该基因一般有两种存在方式，即与GDP结合时的失活状态以及与GTP结合时的活化状态。突变的RAS蛋白降低了自身内源性鸟苷酸三磷酸酶（GTP）的活性，其结果是致使GTP与RAS蛋白的持续结合并具有了促使细胞生长的作用，致使RAS处于一种持续激活的状态中。由于酪氨酸激酶受体等多种信号传导通道的传感器都受该基因编码联系，并可激活多个不同信号传导通道，其结局会导致甲状腺组织细胞转化为恶性。

RAS突变常在特定肿瘤中出现，如RAS突变可见于95%的胰腺癌中。它也是DTC中检测到的最常见的突变之一。不同的肿瘤有不同的RAS基因突变类型，如K-RAS突变与肺癌有关等。DTC中已经检测到多种RAS基因突变如N-RAS、K-RAS、H-RAS，但在MTC组织中几乎从未检测出该基因突变。该基因突变主要存在于滤泡型PTC及滤泡性腺瘤中，但FTC少见[15-16]，该基因突变还对滤泡性腺瘤能否进一步发展为腺癌或者未分化癌具有一定的预测意义，为RAS阳性的腺瘤积极手术切除提供依据。大约10%的FTC可见RAS基因的点突变，并且似乎仅与滤泡亚型FTC有关。RAS点突变型FTC往往伴有滤泡变异型组织学的特性，表现为肿瘤外侵、肿瘤的失分化和出现转移，这在存在骨转移的病例中表现尤为明显[17]。而在低分化DTC组织中往往RAS突变检出率较高，表明该突变会导致DTC更强的侵袭能力。

RAS突变是在DTC中比较多见的事件，具有较高的特异性和敏感性。RAS突变和这些肿瘤的预后及临床特征密切相关，作为一种DTC的诊断学标志具有较广阔的发展前景。RAS抑制剂洛伐他汀已被证实在RAS突变的的甲状腺肿瘤的体内具有抗肿瘤效果[18]，为RAS突变表达的DTC提供了新的治疗方法，可能对限制肿瘤的播散有作用，这还需要临床进一步研究。

综上所述，多种免疫组化结果与DTC的发生、发展、预后和转归有密切关系，而且，每种基因的作用均有所不同。甲状腺标本检测P21-RAS有助于分化型甲状腺癌的诊断，而进行RET/PTC及BRAF检测，不但可以有助于诊断PTC，而且可更好地估计肿瘤的侵袭性及淋巴结转移特点，对于肿瘤的后续治疗方案（如分子靶向治疗等）及判断预后有重要价值。

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篇6

【关键词】 纤维素酶；生物学研究；生物学应用进展

doi：10.3969/j.issn.1004—7484（x）.2012.10.659 文章编号：1004—7484（2012）—10—4174—02

纤维素酶由多种水解酶组成，既能在大自然中合成，也是我国四大工业酶种工业合成的重要组成部分，它是一种可再生的、可持续发展的酶，它的主要作用就是催化纤维素转化成葡萄糖，纤维素酶普遍存在于大自然中，很多真菌能够分泌，纤维素酶多年来也广泛的应用于我国的食品工业、制酒工业以及纺织工业中，对我国发展具有极大的促进作用。近年来，随着生物工程的发展，对于纤维素酶分离纯化、克隆以及其结构的研究已经成为人们研究的热点以及要解决的难点问题。本文主要分析了纤维素酶组分、基因结构、克隆及表达、作用机理、纤维素酶生活中应用以及进展研究。

1 纤维素酶组分

窦全林1等对于不同真菌产生的纤维素酶性质以及种类做了研究，狭义上一般分成纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶以及β葡糖苷酶，内切葡聚糖酶是最初破坏纤维素链并且起作用的酶，纤维二糖水解酶经内切葡聚糖酶激活之后的酶，β葡糖苷酶可以分解纤维二糖，使之成为葡萄糖。通过三种酶的共同作用，能够成功时的纤维素分解，变成葡萄糖，三者称为完全纤维素酶系。

2 纤维素酶基因结构

真菌编码纤维素酶的基因主要在染色体上面，并且随机分布，形成基因簇，各具备自己的转录以及调节相应的单位，转录单位叫做转录终止子，但是目前纤维素酶基因结构上的主要启动因子还不是很明了，值得进行进一步研究。

3 纤维素酶克隆及表达

陈小坚等对纤维素酶克隆及表达进行了研究，纤维素酶克隆及表达主要包括获得高产菌株以及基因、选择宿主、构建表达载体、进行转化等四大阶段。首先是获得高产菌株以及基因，对微生物进行筛选，选出高产菌株，实施诱变措施进行诱变，然后是获得基因，如果已知基因序列的情况下，可以从基因组中调出，未知的情况下，可以从自然界中进行微生物分离以及培养，选择基因进行克隆。其次，真菌是比较好的表达宿主，可以达到分泌蛋白量，进行乙酰化以及糖基化，获得纤维素酶的正确表达，获得很高的蛋白产量。再者是构建表达载体，对筛选方式、转化以及表达的方式以及载体进行构建，争取能够启动强启动子，实现基因转录，提高启动子效率，表达目标蛋白，提高目标蛋白产量。最后是进行转化，主要的转化方式有氯化锂、原生质以及农杆菌等转化方式，有效提高转化率。

4 纤维素酶作用机理

陈燕勤2等对纤维素酶作用机理进行了探讨，在1954年，GiIIigan等学者提出了纤维素酶能够有效的促进纤维素酶的分解的观点，并且复合分解的效果大于单独分解的效果。此后年间，更过的学者对于这种作用进行了证明，证明方法包括电子显微镜以及多种菌种的纤维素酶的应用。随后，Faterstam等发现，纤维二糖水解酶的分解作用是一般的单组酶的两倍之多，并且分解的时候，与内切葡聚糖酶具有协同的作用，随后更多的学者证明了这种理论，目前，专家以及学者们对于这种协同作用理论也大多呈认可或者不反对状态，具体还要做进一步研究。

5 纤维素酶生活中应用

李燕红3等已经对目前纤维素酶生活中应用做了一个比较系统的研究，从1995到2005年，2005年工业上酶使用已经为1995年的三倍，主要来源为美国以及日本，这两个国家是纤维素酶应用的两大巨头，目前纤维素酶以及被广泛的应用于我国的制酒、纺织、饲料以及食品业中，并且对于我国工业起到了极大的推动作用，首先在食品工业中，一方面，主要是进行橄榄油以及果蔬汁的榨取，去除掉果汁以及蔬菜汁的沉淀物，促进谷物水分吸收，去除豆子中的豆衣，实现谷物蛋白以及淀粉的成功分离等。另一方面，纤维素酶可以用于提取纤维寡糖等可溶性糖，脱离细胞壁，取出有用的蛋白等。

其次在制酒工业中，主要有力于葡萄酒以及啤酒的制造，利用纤维素酶，能够促进水解制酒过程中葡萄汁以及大麦汁，有效的分解沉淀物，提高过滤的效率，增加酒香，提高酿酒的效率，促进酿酒业的发展。

再者是在纺织行业中，纺织行业纤维素酶的应用仍然属于比较新兴的应用，主要用于抛光以及打磨两个阶段，日常应用范围也比较广，主要是能够有效的取出衣物表面存在的碎纤维，方便家庭日常的洗涤工作，通过抛光以及打磨两个阶段，提高衣物光泽。

最后是饲料行业。这个行业我我国农业的基础，是保证满足16亿人口大国温饱的关键环节，而纤维素酶又是其中的重点问题，纤维素酶加入到饲料当中，能够起到很好的补充作用，增强动物体能，防止动物反刍事件发生。除此以外，还能通过应用在纤维素物质如去掉谷物壳等中，有效提高动物消化的效率，并且分泌相应的物质，促进动物体内的粗糙粮食得到消化以及吸收。

当前，无论是能源问题还是食品问题都是建设中要解决的重点以及难点问题，纤维素酶作为一种生物工程主要建设工业酶，其成功的提取以及应用，对于保证我国解决能源以及食品问题，促进我国农业发展有着空前意义，纤维素酶凭借其价格以及成本低廉、应用广泛、使用方便等特点，已经成为人们关注的热点话题之一，只有加强对纤维素酶组分、基因结构、克隆及表达、作用机理、纤维素酶生活中应用以及进展进行研究，才能使得各环节出现的问题得到很好的改善，促进各个环节的完善，使得纤维素酶克隆及表达顺利，实现成功的合成，并且利用纤维素酶，为我国的农业、纺织业、制酒业以及饲料行业做出贡献，随着发展的深入，扩展纤维素酶使用的范围，促进纤维素酶的发展，使其使用范围深入到我们生活的各个方面，为我们生活做出贡献。

参考文献

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篇7

末端端粒的长度，随着年龄的变化而变化。因此，可以用分子生物学方法准确推测年龄。

【关键词】d型／l型天冬氨酸，碱基加合物和正常碱基，端粒，分子生物学，年龄

【中图分类号】13919．2；075

【文献标识码l a

【文章编号】1007—9297(20__)01—0040—02

在法医学实践中，经常需要对无名尸体、组织碎块进行

年龄估计。一般情况下应用法医人类学方法对牙齿、骨骼

等检材估计个体年龄。而在很多情况下，现场仅有组织碎

块存在，或者有的部位的骨骼不适合精确估计年龄，在这种

情况下用分子生物学方法估计年龄，尤为重要。体内的许

多物质随着年龄的变化而发生改变，目前有几种物质随着

年龄的改变而发生变化，一种是质的变化，一种是量的变

化。

胶质原存在于人体的各种组织、器官中，胶质原含有d

型、l型天冬氨酸。尤其在牙釉质、牙本质中，d型、l型天

冬氨酸的含量随着年龄的增加会发生改变，d型天冬氨酸

随着年龄的增加而增加，而l型天冬氨酸随着年龄的增加

而发生消旋作用，转变为d型天冬氨酸而含量下降。d型／

l型天冬氨酸的比值随着年龄的增加而增加。在牙本质中

这种变化较稳定，适合于用d型／l型天冬氨酸估计个体的

年龄_1 j。国外许多学者建立了利用天冬氨酸的消旋作用

推测年龄的方法。20__年，pilin等利用此方法计算15～95

岁之间的样本，年龄与d／l型天冬氨酸的比值的关系，其

相关系数达到0．93。此方法的优点在于当牙齿的形态遭到

严重破坏时，可以利用牙本质中天冬氨酸的稳定性来估计

个体年龄。此方法在实际应用中，水解蛋白质和手性分离、

检测氨基酸的衍生物尤为重要，影响结果的准确性，可应用

gc、hplc、毛细管电泳进行手性分离和检测ll 。

随着年龄的增长，人体的体细胞线粒体产生的自由基

增多，自由基的增多会对dna产生损伤。尤其活性氧弓l起

的dna氧化性损伤，导致碱基结构的损伤，进而引起dna

在体内复制时发生突变。自由基对核dna和线粒体dna

都会产生损伤，由于线粒体dna没有组蛋白和hmg蛋白

的保护，更容易产生损伤【6-8 。活性氧对dna的损伤，表

现在dna的碱基形成加合物，在复制过程中，这些碱基产

生错配，导致突变。活性氧是结构最简单、稳定性最差、氧

化性最强、与四种碱基的反应活性最强的自由基，因此在细

胞中最多见的是活性氧导致的碱基损伤，活性氧攻击碱基

的不饱和键形成碱基加合物。人体也存在抗自由基损伤的

修复能力，但随着年龄的增加，修复能力下降。活性氧可和

碱基形成8一oh—g、5一oh—dg、5一oh—du、8一oxo

— da，dug、2一oh—da碱基加合物_6 j。通过对动物细

胞和体外培养细胞的研究，发现随着年龄的增长细胞的碱

基加合物含量会增加，其中8一oh—da、8一oh—g含量

最多。检测碱基加合物和正常碱基的含量，可用于推测个

体的年龄，但这种方法只能粗略估计年龄，适合于组织碎块

的年龄估计。

在人类染色体的末端存在端粒，端粒由蛋白质和dna

组成，真核生物的线型染色体都存在端粒。端粒dna不存

在蛋白质编码基因，端粒基本由六核苷酸核心重复单位

(111aggg)组成，其中有的重复单位存在变异，重复序列问

亦存在一些插人序列。端粒虽然不存在功能基因，但端粒

起着稳固基因组、保护染色体末端、决定核内染色体定位作

用及调控体细胞复制作用l9 。由于端粒调控着体细胞

的分裂、复制，体细胞分裂、复制有一定复制生命周期，端粒

决定体细胞分裂次数，可以说是细胞分裂的“生物钟”，因为

端粒不能进行半保留复制，其复制依赖于端粒酶的存在。

大部分体细胞不存在端粒酶，体细胞每分裂一次，端粒就丢

失一段，随着细胞分裂而不断缩短，因而端粒的长度反映细

胞复制历史。也可以说端粒长度随着个体的年龄变化而缩

短，反映生物个体的年龄变化。而端粒长度的变化不受体

法律与医学杂志20__年第1o卷(第1期)

外因素的影响。细胞每分裂一次，不同的细胞缩短的长度

不同，因此端粒长度可以作为推断年龄的一个理想标

记[1卜15]。

端粒长度的检测方法目前有trf(末端限制性片段

法)、fish(荧光原位杂交法)、 a(杂交保护法)等。这些

方法检测都是46条染色体端粒的平均长度，而不同染色体

的端粒长度存在差别，以及同一染色体的两个端粒亦存在

差别[16]。通过检测平均长度而推测年龄，误差较大。如果

能准确检测一个端粒的长度，推测年龄准确性将大大提高。

随着分子生物学和分子遗传学及相关技术的发展，用

分子生物学方法可以准确推测个体的年龄。

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篇8

【关键词】宫颈癌 放化疗 SCC抗原 MVD；AI

中图分类号：R737.33 文献标识码：B 文章编号：1005-0515（2012）1-042-02

1 引言

宫颈癌的发病率在世界范围内已列居女性生殖系统恶性肿瘤之首 ,对女性的健康构成了严重的威胁。在我国，宫颈癌的发病率也是居高不下，近几年来，增长熟读明显加快，在这些患病女性人群中，中晚期患者占有一定的比例。随着化疗药物在临床的广泛使用，专家学者一致认为同步放化疗能提高中晚期宫颈癌的疗效，已成为当前改善宫颈癌疗效的一种重要方法。在临床的实践表明，中晚期宫颈癌放化疗治疗过程中，不同的患者的治疗效果并不相同，这可能与肿瘤的发生、发展及预后的关系比较密切的生物学指标相关，包括血清鳞状细胞癌抗原（SCC抗原)水平、肿瘤组织的微血管密地（MVD)、细胞凋亡指数（AI)等。因此，了解这些影响放化疗疗效因素的调控机制是非常有必要的。

2 血清鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag))水平

2.1 鳞状上皮细胞癌抗原的基本概念

SCC-Ag全称是鳞状上皮细胞癌抗原，这是一种糖蛋白，它的相对分子质量为 48000。这种特殊的细胞癌抗原是由Kato 等人于1977年从子宫颈的鳞状细胞中分离出来的。SCC-Ag主要存在于宫颈、子宫、头颈等鳞状上皮细胞的胞浆里面，特别是在一些高分化型的大细胞中，SCC-Ag的含量会更丰富。因为SCC-Ag对高、中分化型的宫颈鳞状癌比较敏感，而对低分化型的鳞癌和腺癌的敏感性稍微差些，且与肿瘤的发展有密切的关系，因此SCC-Ag可以作为鳞状细胞癌的标记物。现在国内外的一些研究人员已经把检测到的SCC-Ag的水平作为肺癌、宫颈癌、食道癌等病症的诊断、病情监测及预后判断的辅助指标。大多数的研究表明，在治疗前，宫颈癌患者体内的SCC-Ag含量的升高与组织学类型、临床分期存在着一定的关系；暂时还没有发现与肿瘤的组织分化程度有什么样的关系。同时还表明了血清SCC-Ag的水平能够反映肿瘤的生物学特性，可以作为评价肿瘤患者病情发展的一个重要的参考因素。

2.2 SCC-Ag与宫颈癌临床病理特征的关系

通过研究检测500例宫颈患者放射治疗前后血清SCC-Ag的水平，可以探讨SCC-Ag与宫颈癌生物学行为的相关性。研究人员把资料齐全的，年龄在29~76岁之间的500例宫颈癌患者作为试验的研究对象，并采用美国雅培公司的全自动快速粒子酶免疫分析检测仪进行检测。实验过程中的宫颈癌放射治疗方案请参阅文献[3] ，并采用统计学中的x2检验，其中P=0.05为检验水准。

实验结果表明宫颈癌患者放射治疗前血清SCC-Ag的水平与正常的对照组相比，其值要高一些；经过一系列的放射治疗，血清SCC-Ag的水平明显要低于放射治疗之前的水平。

SCC-Ag与宫颈肿瘤组织分化程度的相关性比较低（p > 0.05），而与宫颈肿瘤组织学类型的关系是比较密切（见表1）。SCC-Ag水平与宫颈癌临床分期也有比较密切的关系（见表2）。

表 1 SCC-Ag与宫颈癌病理特征的关系

* Adenocarcinoma + Others vs. Squamous carcinoma

表 2 SCC-Ag水平与宫颈癌临床分期的关系

* Ⅰvs. Ⅱ；**Ⅱ vs. Ⅲ+ Ⅳ

对于SCC-Ag与宫颈癌预后的关系，许多研究者认为对于治疗前患者的SCC-Ag值可以作为早期宫颈鳞癌的一个比较新而可靠的预后因素，同时他们还认为在治疗前随患者的SCC-Ag的升高，淋巴结阴性患者复发的可能性会比淋巴结阳性患者的高两倍。通过本实验，我们可以清楚地了解患者在治疗前后血清中SCC-Ag显著的变化； SCC-Ag水平的变化不仅可以反应疾病的转归，还可以作为一种判定治疗效果的重要指标。

3 肿瘤组织的微血管密度（MVD）指标与宫颈癌病理的关系

微血管主要包括细静脉、细动脉、毛细血管。微血管密度指的是生物的组织如肌肉、皮肤等组织中单位密度的微血管的数量，通常的微循环研究中是把一定长度范围内或者是1平方毫米内所看到的血管数目称为血管密度。一般在组织标本中可以使用显微镜来计数单位面积或单位体积的血管数目。

研究人员已经通过多次实验检测了微血管密度（MVD）在宫颈癌组织中的表达，他们的实验方法是采用免疫组化SP 法，研究对象是16 例宫颈癌患者、10例宫颈上皮内瘤样变Ⅱ～Ⅲ级（CINⅡ～Ⅲ）患者 、10 例宫颈上皮内瘤样变Ⅰ级（CINⅠ）患者以及10 例慢性宫颈炎患者，然后分别检测患者宫颈组织标本中 MVD 的表达。其实验结果如表3所示:

表3 各组中MVD的计数

注:*三组和对照组对比，P =0.000，P ＜0.05；**CINⅠ组与对照组对比P = 0.573，P > 0.05;#宫颈癌组和 CINⅡ～Ⅲ组对比，P =0.000，P ＜0.05。

从表3中可以很明显得看出对照组、CINⅠ组、CINⅡ~Ⅲ组及宫颈癌组中的宫颈组织中的 MVD 水平是明显不同的，这也就表明了宫颈病变的程度强弱对MVD 的水平是有很大的影响，两者有着很密切的关系。另外，一些研究表明在癌组织中，微血管染色呈现棕褐色，此颜色清晰可变，保证了MVD计数的准确性。一般随着宫颈癌分化程度减低（恶性程度的增高）MVD也会显著增高。MVD可以反映宫颈癌的生物学行为，它是肿瘤生长和转移的形态学基础，可以作为预测宫颈癌侵袭转移的重要指标。

4 细胞凋亡指数（AI）与宫颈癌放射治疗的关系

细胞凋亡指的是有核的细胞，在一定的条件下启动自身内部的机制发生的自然死亡的过程，是细胞程序性死亡的一种形式，同时还会用一种与有丝分裂相反的方式调节细胞群体的相对平衡。不仅能够在细胞发育、增值、分化、死亡等过程中起作用，而且在细胞信息传递、肿瘤消退及肿瘤发生等方面有着重要的意义。因此，有关细胞凋亡的研究受到了学者们更多的关注。

为了进一步研究宫颈癌中细胞凋亡指数与放射治疗临床效果之间的具体关系，进行了如下的实验。对35名宫颈癌患者在放疗前与放疗一周后，（放疗用肿瘤剂量(DT)900~1000cGy）取其标本，然后检测细胞凋亡指数与凋亡相关基因bcl-2/bax，用到的测量方法有原位DNA末端终止法和免疫组化法(IHCA)。实验过程中测量的数据如表4、表5、表6所示。表4给出了放疗前和放疗第1周后(DT量为900-l000cGy)AI变化；放疗前和放疗第1周后bcl-2 / bax 蛋白表达和细胞凋亡的关系见表5；表6给出了放疗前后细胞死亡指数与临床疗效的关系。

表4 放疗前BAI和放疗后诱导AI的变化(%，x±s、)

表5 宫颈癌组织bcl-2、bax蛋白表达与AI关系(%，x±s、)

表6 放疗前BAI与近期疗效的关系

实验结果：AI在放疗前和放疗第1周分别为1.21%士0.78%、29.8%士8.4%，有着明显的差异 (P1.21%的临床疗效要高于BAI

细胞凋亡不仅在肿瘤患者的放疗机理方面有着重要作用，同时还是影响肿瘤细胞固有放射敏感性的重要因素之一，细胞凋亡本身是要收凋亡基因控制的。

5 总结

本文主要讲述了与宫颈癌放疗和同步放化疗疗效相关的三种分子生物学指标，目前的研究者对上述问题的研究还相对较少，采用的发方法与手段也不同，得出的结论还有待进一步更全面的研究。当前宫颈癌的基础以及临床研究热点是宫颈癌的放疗和同步放化疗敏感性的预测，通过以后深入的研究和大规模的实验，相信会研究出更有知道意义的分子生物学指标。

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篇9

CD44是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，在淋巴细胞，成纤维细胞表面均能检测到它的表达[1，2]。CD44蛋白属于未分类的粘附分子，其正常功能是作为受体识别透明质酸（HA）和胶原蛋白Ⅰ、Ⅳ等，主要参与细胞-细胞，细胞-基质之间的特异性粘连过程。

1.1 CD44基因的定位与结构

人类CD44基因位于11号染色体短臂上，有20个高度保守的外显子，完整基因组在染色体DNA上大约跨越50kb。CD44基因的外显子按表达方式分为两种类型：一种是组成型外显子，另一种是V区变异型外显子。组成型外显子有10个，其中转录片段存在于所有CD44转录子中。仅含组成型外显子的CD44转录子，称为标准型CD44（CD44S），它编码361个氨基酸（Aa）。V区外显子也有10个，在基因组上位于第5和第6个组成型外显子之间，在染色体DNA中专25kb。含有V区外显子的CD44转录子统称为CD44拼接变异体（CD44V）。V区外显子的拼接方式非常特殊，它们既能以连续方式拼接，也能以跳跃方式拼接，参与拼接的V区外显子多少不一，从而使转录片段长短不一。目前通过PCR技术在许多细胞系中已发现10多种CD44V。早期发现血细胞的CD44分子（CD44H）为标准型。最先获得克隆的拼接变异体是含有CD44V8-10的CD44V，它主要存在于上皮细胞又称为上皮细胞型CD44V（CD44E）。目前对CD44的研究较多，如V3、V5、V6。

1.2 CD44分子的结构特征

从已知的cDNA序列推测，CD44S由341个Aa组成，N-末端起台于21位Aa，前面20个Aa为信号肽，紧接着是胞质外区域的248个Aa，第249个Aa至269位的21个是疏水性的，为跨膜区，其后是胞质内C-末端尾部有72个Aa。另外还有一种CD44S的短尾形式，其胞质内C-末端尾部仅3个Aa。这种Aa序列具有Ⅰ类膜蛋白的特征。Lokeshwar等[3]用实验观察CD44S分子的合成过程，发现CD44分子首先被合成43KD的蛋白前体，接着在内质网内进行N-糖基化，形成58KD的N-糖基化前体，其后在高尔基复合体内进行O-糖基化和其它翻译后修饰，形成最终的85-95KD分子。

1.2.1 CD44S胞质外结构域特征：CD44S分子信号肽的N-末端的130Aa内编码了5个Asn-x-Ser/Thr序列和6个半胱氨酸残基，前者是5个N-糖苷键连接位点，其中3个被利用。6个半胱酸形成3个二硫键，形成球形结构域，这一球形结构域的重要特征是与动物连接蛋白有较高的同源性。有两个区域与透明质酸结合，分别是21-45Aa，135-195Aa。

CD44S的胞外近膜区存在一个56Aa的结构域（161Arg-216Asp），含有19个ser和Thr残基，常以2～4个成簇，这些是已知的O-糖基化位点特征，表明CD44有7个潜在的O-糖基化位点，其中4～5个位点被利用。此外这一区域含有4个Ser-Gly二肽，是潜在的硫酸软骨素连接位点。并且已得到证实，CD44分子加上硫酸软骨素后，与其结合细胞外基质的能力有关，包括Ⅰ型胶原、层粘边蛋白、纤粘连蛋白。

CD44分子细胞膜外区域有多个潜在的N-糖苷键连接位点，可连换多个碳水化合物，不仅与分子成熟过程中的翻译后修饰有关，也与细胞的功能状态有关。糖基化赋予CD44分子异质性，而其异质性与不同的O-糖基化程度有关，这种现象是CD44分子所特有的。这种新的糖基化调节方式在CD44S结合不同的细胞外基质成分的能力方面超着重要作用。深入研究这一分子的糖基化调节机制及生物功能方面的联系是十分有意义的。

1.2.2 CD44S胞质内结构特征：CD44S分子第249-269跨膜区的Aa序列中存在一个半胱氨酸残基，代表着一个潜在的脂酰化位点，这一位点可与软脂酸连接导致CD44分子脂酰化。在CD44S的胞质内区域尾部存在一结构域可与锚蛋白（ankyntn)结合。胞质内尾部序列有5个保守的丝氨酸残基，可作为蛋白激酶C（PKC）的底物被磷化[4]。上述脂酰化过程均可增强CD44S分子与锚蛋白的结合能力。比较CD44S和其他G蛋白的序列发现存在4个 同源性高的区域，实验证实CD44还是一种GTP结合蛋白，可结合GDP底物并且有GTP酶活性，显著增强CD44与锚蛋白的相互作用[5]。在CD44合成过程的各种中间产物，发现均有锚蛋白结合位点和结合活性，提示糖基化对锚蛋白结合位点的形成无关，并且结合锚蛋白对于CD44分子的输送和信号传导功能起重要作用。

1.2.3 CD44V的特征：目前发现10个V外显子编码的氨基酸中有约30%的丝、苏氯酸残基，具有广泛潜在O-糖基化位点，如：V6具有潜在的O-糖基化位点。V3外显子序列分析中发现Ser-Gly-Ser-Gly片段，它可结合硫酸肝素，结合硫酸肝素后的CD44V能与碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）结合肝素的表皮生长（HBEGF）因子结合，此结果提示这种CD44参与了传递细胞因子的过程。

1.3 CD44蛋白的主要功能

CD44基因编码合成的CD44蛋白具有一系列功能，包括：①作为导向性受体，调节淋巴细胞在血液和淋巴液间的运行，即淋巴细胞归巢或再循环[6]。②在淋巴细胞自溶、离体淋巴细胞的活化中发挥作用。③促进成纤维细胞和淋巴细胞与胞外基质成分如透明质酸、硫酸软骨素、纤维素、糖原等的粘附。④参与信号传递蛋白可影响蛋白在细胞间的位置，刺激其分泌特异的生长因子具不同的传导作用。⑤结合并中和透明质酸，该作用类似于清除间质组织。⑥调节药物的吸收及细胞对药物的敏感性。

究竟是何种CD44蛋白参与了何种调节，至今不清楚，选择性剪切过程中的多样性CD44蛋白与细胞结合的多样性也表明其中有重要的协间或调节功能[7]。有研究认为，跨膜的CD44糖蛋白，其膜外成分的变异与细胞粘附及导向作用有关[8]。，而胞内分子的尾部则与活化T淋巴细胞的潜在作用有关，而且胞内分子长度可调节蛋白激酶A/C位置，影响细胞的信号传递[9]。

2 CD44分子在肿瘤细胞中的表达

1989年Stamenkevie等使用不同的单抗分离和克隆了一个编码CD44标准型的cDNA，该基因不仅由淋巴样细胞表达，也可由不同的癌细胞系包括实体瘤典型标本中表达。在裸鼠研究某些人的转移癌时发现，CD44基因表达在转移中起作用。在大鼠胰腺癌细胞中非转移性细胞株只表达标准CD44（CD44S），而转移性细胞株表达CD44V，而且将CD44V变异体cDNA转染到非转移性的细胞株可引起转移[10]。Hofmann[11]用 notherm印迹法研究了20多个体外培养的人癌细胞系，也发现许多肿瘤组织能表达CD44V，但在不同细胞中V区外显子的转录拼接模式不尽相同。第一份临床肿瘤标本（结肠癌）的检测结果是1992年由英国年津大学病理实验室的研究人员首先报道的，以后人们应用免疫组化及RNA-cDNA-PCR印迹杂交在肺癌、结肠癌、食道癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、宫颈癌、肾癌和非何杰金淋巴瘤等中发现有CD44V表达。认为CD44V5、CD44V6的表达与肿瘤进展程度、转移及预后密切相关[12]。对于各种癌的实验研究已经进入肿瘤的发生、生长、转移增殖潜能及预后复发各环节与CD44分子表达的相关性，并提出实验数据和假说加以论证。

2.1 CD44分子与肿瘤的发生、生长、发展

癌的发生发展与癌基因（c-erb2、c-myc， ras）和抑癌基因（P53，nm23）等异常表达有关。有研究表明CD44异常表达可早于ras、P53等基因的异常，所以CD44的变异可能与ras部基因激活有关，是癌形成的一个因素[13]。Muider[14]对结肠癌肿瘤P53突变和CD44蛋白的研究，在结肠肿瘤各期中观察到有统计显著性的P53、CD44V6表达增强的趋势，P53和CD44V6表达间有显著相关性。P53被认为监视基因突变的“分子警察”，失活的P53可引起失控的肿瘤生长，因此P53突变引起失去最后控制时，V6‘表型获得明显的生长优势’。郭亚军等[15]用抗CD44的单抗以阻断其与透明质酸的结合，从而抑制CD44阳性的肿瘤细胞在体内的生长。他推测肿瘤细胞的生长可能是CD44阳性的细胞能与细胞外基质（ECM）中的透明质酸结合，从而获得附着性，并更易从ECM中获得生长因子。FasanoM等[16]报道成人非肿瘤患者肺泡Ⅰ型上皮不表达CD44V6。Ⅱ型上皮细胞和基 底细胞有CD44V6低量表达，Ⅱ型细胞与基底细胞属于干细胞，估计CD44V6对于肺生长有重要意义。所以认为CD44V6对于幼稚细胞生长和对于肿瘤细胞生长的机理可能相似。Lu等[17]发现在宫颈腺癌，无论是原位癌还是浸润癌均有CD44S弥漫表达，且浸润癌比原位癌明显高表达CD44S，几乎所有的原位癌与浸润癌CD44V9均增加，仅有较少的浸润癌表达CD44V4与CD44V6，而原位癌几乎不表达。说明宫颈上皮的癌变与CD44S和几种CD44V表达的量变和质变有关。

2.2 分子表达与肿瘤的转移、侵润

Matsumura等[18]用PCR技术检测了转移性结肠癌、非转移性结肠癌、正常结肠粘膜的CD44基因表达活性，发现转移性结肠癌细胞CD44变异拼接外显子表达明显增强。Pales等[19]用单克隆抗体检测以CD44表达情况发现，在人类结肠癌标本中，CD44V在浸润和转移的肿瘤中呈阳性表达，并认为CD44V的表达可作为结肠肿瘤浸润的标志。Herrtich[20]研究发现在一些分化不良的息肉中检测以V6外显子在肿瘤浸润中有增强的高频率表达，推测表达CD44V6的肿瘤细胞能够有利于癌细胞浸润和转移的条件。

Granberg等[21]发现在支气管类癌瘤患者，表达CD44S可减低远距离转移，CD44V77-8阳性肿瘤降低远距离转移风险，CD44V9阳性可降低远距离转移及死亡，而CD44V4、CD44V5、CD44V10与临床结果无关，证明支气管类癌瘤具有潜在恶性，CD44S、V7-8、V9阳性可能引起较好的临床结果，可以考虑作为预后评估的指标。

关于CD44V与肿瘤转移相关性的假说如下：激活的淋巴细胞和转移的癌细胞具有许多共性，即都有很强的侵出行为，均有可逆的粘附接触过程进行细胞迁移，在引流淋巴结中两类细胞皆能大量积聚和快速增殖，最后它们都能释放到循环系统，并通过外渗作用进入周围组织，这些相似性很可能基于CD44V6在二者中的共同作用，提示CD44V6在淋巴细胞活化中的作用机理与CD44V6在肿瘤转移中作用机理是相同的。即CD44V6高表达的癌细胞可能获得淋巴细胞“伪装”，逃避人体免疫系统的识别和杀伤，更易进入淋巴结，形成转移[10]。

有结论认为CD44V6变异体可能通过促进癌细胞与血管内皮细胞和细胞外基质的粘附，促进肿瘤细胞向基质侵袭，从而影响肿瘤细胞的迁移和运动能力。也有结论认为CD44V6可能通过影响癌细胞的骨架构像和分布，从而影响癌细胞的运动能力，而影响癌转移。

3 CD44分子对治疗肿瘤的展望

因为CD44V6对于肿瘤的发生、发展都有一定的相关性，推测CD44V6与肿瘤的分型、分化、分期有一定关系，如果这种关系得以明确，我们就可以通过癌组织CD44V6的表达程度来判断癌的类型，所处时期来进行适当治疗。

有研究认为CD44V6的表达要先于抑癌基因的表达，如果能够检测出CD44异常表达，则对于癌的早期诊断有密切关系。已有研究表明，CD44V6可用于诊断。如1997年吴忠等报道，应用RT-PCR技术检测CD44V6在30例尿液标本脱落细胞检测到CD44V6的表达，而在膀胱炎患者和正常志愿者未检测到CD44V6的表达。

肿瘤的转移是癌症患者的主要死亡原因，Seiter等[10]用抗CD44变异型蛋白的抗体与CD44变异型产物相结合，显示鼠癌细胞的转移潜能被终止，这也为大肠癌的治疗提供了又一个可能途径。

手术切除的肿瘤标本中如有CD44V6蛋白阳性，常会伴术后肿瘤再发或远处转移。CD44V6可作为一种有效的癌预后的标志物，用以指导治疗方案的制定。

CD44基因及其选择性剪切在癌的预测、早期诊断、病情进展、转移潜能与预后的估计等方面具有很大的潜在价值。随着分子生物学不断的发展，癌基因研究的不断深入，相信该基因对癌的预测、诊断、治疗、预后的价值会得到更加全面的认识。

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篇10

【关键词】 子宫腺肌病;血管生成;免疫

Abstract:Adenomyosis (AM) is the common disease in department of gynaecology. In clinical aspect， it has the characteristics of implantation，recurrence and invasive growth of endometrial tissues which are similar to biological behaviors of malignant tumors. However， their mechanisms have not been well-clarified yet. The pathogenesis of human adenomyosis might be correlated with the factors of vascular formation， immune， apoptosis， neurophysin receptor and heredity

Key words:adenomyosis(AM);vascular formation; immune

子宫腺肌病(adenomyosis)是指具有生长功能的子宫内膜腺体和间质在多种致病因素的作用下侵入子宫肌层而引起的以经量过多、经期延长、继发性痛经渐进性加重为主要临床表现的良性病变。该病首次由Frank命名，为良性疾病，但在生物学行为上具有粘附、侵袭、转移等许多类似恶性肿瘤之处。近年来，随着分子生物学和现代诊断技术的发展，许多学者对本病的发病机制进行了深入的研究，提出了许多相关因素。现就近年来有关本病发病机制的分子生物学研究概况综述如下:

1 血管生成与子宫腺肌病的相关性

近年来血管因子在细胞的增生、迁移发生过程中的重要意义受到学术界的重视。研究表明，血管生成可能在子宫腺肌病发病过程中起重要作用[1]。Han[2-3]用免疫组化染色发现子宫腺肌病的子宫内膜和肌层的血管生成活性显著升高。Hirotaka[3]通过宫腔镜检查发现近一半的子宫腺肌病内膜有异常血管形成。某些血管生成因子活性增高或是抑制因子活性降低，或两者平衡失调，经过一系列过程形成新生血管，其中至少包括微血管基底膜和细胞外基质的降解，血管内皮细胞迁徙及增殖分裂，新的原始血管分化成熟，最后形成新的毛细血管。以上过程受到多因素的调节，如血管生成因子、细胞因子、整合素家族和其他黏附分子、成纤维生长因子、蛋白水解酶、透明质酸酶及小分子物质等，其中血管生成因子家族在血管生成中起着非常重要的作用，该家族包括血管内皮生长因子(VEGF)、血小板来源的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、肿瘤坏死因子(TNF)等，而VEGF是最为关键的因素，其他因子最终都是通过它而发挥调节血管形成作用。

VEGF通过增加血管通透性，改变血管细胞基因表达，促进血管内皮细胞的有丝分裂等途径导致新生血管形成，成为目前公认的最关键的促血管形成因子，是参与调控血管生成的最重要的血管生长因子，它在组织中的表达反映了该组织的血管生成活性。

2 免疫与子宫腺肌病的相关性

免疫系统是机体的一个重要功能系统，担负着免疫防御、免疫监视与免疫自稳的功能，但免疫系统功能失调可引发或促进疾病。近年国外有研究表明，子宫腺肌病患者的细胞免疫和体液免疫均增强，免疫功能失调在子宫肌腺病的发病中可能起一定的作用[4]。

2.1 细胞免疫

(1)免疫细胞：包括T细胞、B细胞、单核- 吞噬细胞、NK细胞等。正常的子宫内膜间质中具有一定数量的免疫细胞，约占子宫内膜间质细胞的10%～15%，主要成分为T细胞与巨噬细胞，免疫细胞数量及功能的异常与子宫腺肌病的发生发展密切相关。Propst 等[5]用免疫组化染色证实子宫腺肌病组织确实表达巨噬细胞单克隆刺激因子(GM – CSF)，且GM - CSF 配体的表达在子宫腺肌病组织腺上皮比在位内膜明显增加，尤其在月经周期的分泌期更明显。表明子宫腺肌病腺上皮产生的GM- CSF 配体水平上调，可能在子宫腺肌病活化的巨噬细胞水平的增加上起作用。

(2)细胞因子：细胞因子( cytokine， CK)是指由免疫细胞和某些非免疫细胞(如血管内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞)经刺激而合成、分泌的一类小分子蛋白质，主要调节免疫应答、参与免疫细胞分化发育、介导炎症反应、刺激造血功能并参与组织修复等。免疫细胞数量及功能的异常，导致其分泌的细胞因子发生变化，而细胞因子的变化，又可影响局部一些生长因子的活性，从而引发疾病。

ENA-78属于趋化性细胞因子超家族，主要来源为活化的巨噬细胞，对中性粒细胞有特异性趋化作用。有研究显示，子宫腺肌病患者体内存在着一系列的免疫反应，包括细胞表面抗原表达增强、巨噬细胞活化及免疫球蛋白和补体成分的沉积，激活的免疫细胞分泌不同的细胞因子或生长因子，如IL-1、TNF、IFN-γ等，形成复杂的细胞因子网络， ENA-78是其中一个重要环节，有学者报道在子宫内膜上皮细胞产生ENA-78和IL-8可增加IL-1、TNF、IFN -γ的量[6]。

基质金属蛋白酶(MMPS)是一类降解细胞外基质的酶，主要参与细胞外基质的重建，在很多生理和病理过程中发挥作用。Qiu F等[7]于2006年研究认为，AM异位内膜组MMP-2的表达显著高于在位内膜组，提示MMP-2的过度表达使内膜的侵袭力增强，异位内膜组织能降解包括基底膜在内的ECM成分，破坏了阻止子宫内膜侵入的“天然屏障”，为AM异位病灶的形成提供了条件。

E-cadherin属粘附因子家族，其功能主要是调节细胞与细胞之间的黏附反应，对维持组织结构形态起重要作用。有学者研究发现，在月经周期的各个阶段，子宫内膜中E-cadherin都有表达，而在分泌期明显高于增殖期，主要在上皮细胞表达。子宫腺肌病是雌激素依赖性疾病，子宫内膜分泌雌二醇、孕酮能力增强或其受体表达能力增加，使局部激素水平上升，从而导致E-cadherin表达增强。在妊娠、流产等因素作用下，子宫内膜、子宫内膜—子宫肌层连接区、子宫肌层受到损伤，而高表达E-cadherin的子宫内膜腺上皮细胞有较强的黏附力，在其与子宫内膜接触后，黏附并在子宫肌层生长，形成异位的子宫内膜，发生子宫腺肌病，这也解释了肌层中的异位内膜与宫腔表面的子宫内膜有直接通道相连的病理表现。我们认为E-cadherin在子宫腺肌病的发生、发展过程中发挥了一定作用。

(3)人类白细胞抗原( human leucocyte antigen，HLA)是人类主要组织相容性抗原，由抗原呈递细胞使抗原内在化并降解、加工抗原，然后作为免疫原复合物释放至细胞表面。HLA-DR(主要组织相容性复合物- Ⅱ型抗原(MHC - Ⅱ))是经典的HLA基因之一， 其被巨噬细胞识别，进而激活T细胞并刺激B细胞产生抗体，研究结果[8]显示子宫腺肌病的在位和异位内膜腺上皮细胞中HLA-DR 抗原的表达比正常子宫内膜明显增高， HLA-DR 优先分布于子宫腺肌瘤的腺上皮细胞，且分泌期高于增殖期。HLA-DR抗原表达升高引起抗原传递以及其后的免疫反应异常可能是子宫腺肌病发病的原因之一。

2.2 体液免疫

在子宫腺肌病患者的外周血中存在自身抗体，如磷脂次黄嘌呤IgG、磷脂酰甘油IgG和磷脂酰丝氨酸IgG的增高，在切除子宫或使用达那唑治疗后，这些抗体明显下降，说明了与自身免疫性疾病和反复流产有关的抗磷脂抗体的存在，也预示了该病患者常常伴发不孕和体外受精成功率低。同时，相关研究报道补体系统通过沉积C3和C4也参与子宫腺肌病的免疫调节。

3 细胞凋亡与子宫腺肌病的相关性

细胞凋亡又称程序性死亡(PCD)，指有核细胞在凋亡刺激信号的作用下，通过启动细胞内死亡机制，经过一系列信号传导途径，最终发生细胞程序性变性和坏死的主动死亡过程，是受高度调节的生理过程，它与细胞有丝分裂相互协调，共同调控胚胎发育、形态发生、正常组织的更新，同时消除多余、衰老和受损伤的细胞，以维持机体内环境的稳定[9]。目前， 已经认识到， 细胞凋亡不仅参与了胚胎发生、组织塑形、造血调控、发育、生殖、老化、免疫等生理过程， 而且与病毒感染、增殖性疾病、肿瘤等多种疾病的发生及治疗有关。子宫腺肌病是一种增殖性疾病，因此它的发生可能与凋亡调控基因有关。

Survivin 基因：Survivin (生存素)作为凋亡抑制蛋白( inhibitor of apop tosisp rotein， IAP)家族中的新成员， 越来越受到学者们的重视。Survivin 位于17q25染色体上，与细胞分裂、增生有关，是目前发现的最强凋亡抑制基因，是通过直接抑制凋亡通路下游的caspase - 3 (半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶- 3 )和caspase - 7而发挥抗凋亡作用[10]。Survivin主要分布于胚胎及分化不成熟的组织中，在正常成人分化成熟组织一般不表达[11]。生存素高表达时能促进细胞增殖，参与调节细胞的有丝分裂，并能对抗各种凋亡诱导因子如IL-3、TNF-α、Bax、Fas和某些抗癌药物及放射线等的作用，可调节细胞周期，并可参与血管生成，而一些细胞因子如血管内皮生长因子(VEGF)还可以促进生存素再表达[12]。汤淼等[13]采用免疫组化抗生物素蛋白-过氧化物酶染色法(SP法)检测Survivin在AM (子宫腺肌病)中的表达发现: 腺肌病中异位内膜生存素高表达，细胞凋亡抑制作用增强，增生增加，使异位内膜细胞存活期延长，细胞死亡与增生失衡，过度的增生使增生性疾病发生。由此推测，生存素引起的凋亡抑制可能是腺肌病发生的一个因素。

4 激素、受体蛋白与子宫腺肌病的相关性

子宫腺肌病通常被认为是一种雌激素依赖性疾病， 多见于育龄期妇女，绝经后异位的内膜组织逐渐萎缩被吸收，如使用雌激素替代疗法可使原病变复发，其异位内膜也随卵巢分泌的甾体激素周期性变化而改变，均提示本病与雌激素水平相关。目前雌激素在子宫腺肌病发生发展中的重要作用已经得到公认。

Noel JC[14]等发现子宫内膜异位症腺体、间质及肌层均有PR (孕激素受体)及ER (雌激素受体)的表达，且主要集中在异位病灶，在月经周期的各个阶段均为PR>ER，除直肠阴道异位病灶外(增生期PR及ER的表达水平高于分泌期)，其他部位异位病灶无明显周期性变化。还有学者发现异位病灶本身还能分泌雌激素，因异位内膜中雌激素合成酶的含量增加，使组织中的雌激素水平异常增高所致，这些酶包括芳香化酶细胞色素P450、17p羟类固醇脱氢酶2型、硫酸雌酮脂酶。异位间质细胞芳香化酶高表达和雌激素浓度增加，促进环氧合酶- 2 (COX - 2)活性，增加前列腺素PGE2 生成[15]。反过来， PGE2通过增强异位内膜芳香化酶活性，进一步促进雌激素生成，如此芳香化酶- 雌激素- 前列腺素在子宫内膜异位组织内形成正反馈调节循环。动物实验中发现子宫腺肌病的小鼠血清中有高水平的催乳素，子宫催乳素受体表达也增加;研究还发现子宫腺肌病异位子宫内膜腺上皮绒毛膜促性腺激素、黄体生成素的受体基因mRNA 和受体蛋白的表达明显高于在位子宫内膜，而间质细胞的表达无明显差异，提示子宫内膜腺上皮绒毛膜促性腺激素、黄体生成素受体表达水平的升高与子宫腺肌病的发生有关。

5 遗传基因与子宫腺肌病的相关性

Patois等[16]发现异位子宫内膜间质细胞可见染色体(7q) (q21.2. q31.2)部位缺失。Zong 等[17]发现HLA - DQA1 0301 和0401 等位基因与子宫腺肌病和子宫内膜异位症均有关，两者可能在HLA - DQA1 和HLA - DRB1 等位基因频率上有共同的发病机制。此外，还有众多关于癌基因与子宫腺肌病的研究，p53、MDM2、和p21Waf1都是癌基因蛋白，他们都具有调节细胞周期的能，Anas-tasiaa[18]等的研究发现这些癌基因蛋白在子宫内膜异位症中表达而在子宫腺肌病不表达，p53， MDM2，和p21Waf1癌基因蛋白的表达表明了这些癌基因蛋白在调节子宫内膜异位症的细胞生长中起作用，但是在子宫腺肌病中没有调节作用。近年研究还发现，氧自由基代谢失衡可引起组织细胞发生破坏性的反应，与子宫腺肌病的发生有一定的相关性。同时，多次妊娠分娩及宫腔操作均可造成子宫内膜和浅肌层的损坏，有利于基底细胞增生并侵入子宫肌层。

综上所述，子宫腺肌病虽为良性病变，但具有恶性肿瘤远处转移、种植和生长的恶性生物学行为，探讨本病的发生机制有利于临床选方用药及新药的研发，提高本病的治愈率，减少远期复发率。

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关键词 心房颤动 电重构 离子通道 连接蛋白 血管紧张素 分子生物学

心房颤动（AF）是心律失常领域的热点，广大心电生理专家及临床心脏科医生对其发生机制、临床特点及进行了积极探讨，获得较多可贵的资料。近年来的研究发现，AF及快速心房起搏能引起心房电生理功能的改变，促使AF的发生和维持，这种现象称为心房电重构，现将其发生的分子生物学机制的近期资料综述如下:

1、 AF或快速心房起搏引起的心房电重构：

对AF或快速心房起搏引起的心房电重构有较多的研究资料。Morillo等[1]通过动物实验发现，以400次/分的频率起搏心房能引起持续AF，且AF引起的快速心房激动是AF引起心房电重构的基础。随后许多学者通过快速起搏心房的建立实验模型，来研究快速起搏所导致的心房电生理的变化，即心房电重构的特点。部分研究证实[2，3]，AF能降低心房的有效不应期（AERP），AF发生数分钟AERP就会降低，但AERP的降低需持续数天致数周才恢复正常。根据Janse提出的多子波[4] ，AF的发生并维持是由多个子波共存于心房，这些子波围绕着处于不应期的肌束或肌小岛激动，每一个子波在播散过程中可能消失、分裂或与邻近的子波融合，从而使整个心房激动与收缩处于紊乱状态，所以发生AF。同时发现，AF的发生与维持与子波的数目有关，即在AF发生的心房中，其AF的发生与维持的基础是心房能容纳至少4-6个折返子波，否则AF不能发生或即使发生亦极易自行终止，而心房所能容纳的子波愈多AF亦愈易发生及维持。AF波长等于AERP乘以传导速度，所以AERP的缩短导致AF波长缩短，这样心房内所能容纳的子波数目增多，AF更容易形成和维持。

2、AF引起心房电重构机制的离子通道的分子生物学基础

2.1 AF的钾电流变化的分子生物学基础

钾离子通道是广泛存在、种类繁多、十分复杂的一类离子通道。在人心房肌存在的主要有瞬时外向钾电流（Ito）和持续外向钾电流（Iksus）及ATP依赖钾电流（ATP-dependent K+ current）。瞬时外向钾电流是动作电位复极早期出现的外向电流，分为两类：Ito1是复极1期的离子流，Ito2是依赖于肌浆网的Ca离子流。而在人心房肌细胞起主要作用的是Ito1。大量研究证实AF的发生与心房有效不应期的缩短是密不可分的[5，6]。从理论上讲，心房肌细胞复极相外向电流的增加才能导致AERP缩短。但周等人[7]发现AF患者心房肌细胞外向钾电流的两个主要成分Ito和Iksus在不同去极化电压下均较窦性心律患者明显减小。Van wagner等[8]亦发现慢性AF患者左、右心耳Ito的电流密度较窦性心律患者减少。这一矛盾结果是否有其依据呢？许等人[9]对AF患者Ito电重构的分子生物学基础进行了研究，他们逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组化和免疫电镜方法检测窦性心律、阵发性AF、慢性AF患者右心耳组织电压依赖性kv4.3钾通道α亚基基因和蛋白进行半定量。发现阵发性AF及慢性AF的kv4.3αmRNA及蛋白的表达水平明显低于窦律组。而人类Ito1的主要编码基因是kv4.3α，所以kv4.3αmRNA及蛋白的表达水平明显降低较好的解释了AF电重构所导致的Ito1电流密度减少。那么，怎样解释kv4.3αmRNA及蛋白的表达水平明显降低与不应期缩短这一矛盾关系呢？Brudel等[10]认为AF时kv4.3钾通道基因和蛋白表达下调是机体细胞阻止心房肌电重构AERP缩短而引发的自身适应结果，是一被动过程。也就是说，心房肌电重构AERP缩短通过某种机制触发Ito1电流变化，以阻止AERP的缩短，具体机制仍不清楚。

等[1]发现，快速起搏犬的心房7小时后可见心房肌线粒体肿胀和肌浆网破裂，这是细胞内钙超负荷的特征性改变。Leistad等[11]发现急性AF的细胞内钙离子的含量增加1倍。Ausma等[12]研究发现山羊AF模型的心房肌细胞内质网和线粒体的钙明显增多。细胞内钙离子的过载导致钙离子内流减少，心房复极的平台期缩短或消失，所以心房复极时间及AERP亦缩短。目前的研究资料表明[13]，尽管AF时心房电重构导致Ito1及L型钙电流的减弱，但真正引起AERP缩短的是L型钙电流的减弱，导致动作电位时程的2相平台期消失。对于钙离子通道电重构的分子生物学基础，张等人[14]采用RT-PCR法检测风湿性心脏病伴阵发性AF、慢性AF≤6个月和慢性AF>6个月患者心房肌L-型电压依赖钙通道α1c亚基的mRNA的表达，发现L-型电压依赖钙通道α1c亚基的mRNA在阵发性AF、慢性AF≤6个月和慢性AF>6个月患者心房肌上的表达均有不同程度的下降，尤其以AF>6个月患者心房肌上的mRNA下降最显著。Lai等[15]研究发现阵发性AF和慢性AF≤6个月患者心房肌上L-型电压依赖钙通道α1c亚基的mRNA表达无明显变化，而慢性AF>6个月患者心房肌上的表达L-型电压依赖钙通道α1c亚基的mRNA表达显著下降。因此认为，慢性AF>6个月患者心房肌上的表达L-型电压依赖钙通道α1c亚基的mRNA表达显著下降是IcaL重构的分子基础。而阵发性AF和慢性AF≤6个月患者心房肌IcaL下降不是源于钙通道基因的转录水平下降，可能与转录后调节异常和/或蛋白降解系统的激活有关，亦可能与L-型钙通道的电化学特性的变化有关。

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一、善待错误资源，树立学习信心

作为老师，当学生出现错误时，应该换位思考，多站在学生的角度去想想他们此时的心理状况和情绪。可以常常告诉学生：失败乃成功之母，不要害怕错误，学习就是在不断出现错误、不断纠正错误中前进的。课堂上，在学生出错时，老师要做的不是责备或任由同学取笑，而是理解和鼓励，为学生营造一个有安全感的学习氛围，使他们敢于行动，继续不断地探索和思考。特别是老师应给这样的学生再一次表现的机会，并当取得一点点进步时，及时给予肯定和鼓励。

一些优秀的老师就在教学中用开“绿灯”的方式对待学生的错误，在课堂上提倡几个允许：错了允许重答；答得不完整允许再想；不同的意见允许争论。他们在民主气氛中学习，思维活跃，敢说、敢做、敢问，勇于创新，而且师生的关系也非常融洽。这盏“绿灯”使他们的自尊心得到了切实的保护，信心也得到了充分的激发。

二、妙用错误实例，培养发现意识

学生获得知识本来就应该是在不断的探索中进行的。在这过程中，学生的思维方法各不相同的，出现偏差和错误是正常的。

曾听过一位老师教学《林海》一课，有位学生把“大不一样”读成了“不大一样”。表面上看这只是两个字的字序颠倒，其实意思的出入却很大，所以老师没有简单地纠正一下了事，而是以此为契机及时调控，趁势进行追问：“他哪儿读错了？”“这两个词有什么不同？”学生很快回答：“‘大不一样’说明差别很大；而‘不大一样’说明差别不大。”老师进一步引导：“仔细读一读课文，体会一下秦岭与大兴安岭的差别究竟大不大？”学生再读课文后，有学生明白了：“差别其实很大，秦岭是‘云横秦岭’，而大兴安岭是‘那么温柔’。”老师根据学生的回答，随即板书作图小结：“一个险峻，一个温柔，看来二者确实是――大不一样。”

由此可见，错误是有价值的一种资源。课堂上“意外”情况发生时，老师妙用错误的实例，及时调整教学环节，往往就能产生耳目一新的课堂效果。

三、智用将错就错，发展思辨能力

课堂教学中，当学生出现与预期答案不符的回答时，如果老师能利用学生的错误资源“将错就错”，就能使学生体验知识的内在联系与区别，还能激发他们进入思辨的新境界。

有位老师上《黄山奇石》一课时，让学生汇报课文中有哪几块黄山奇石。当汇报到“金鸡叫天都”时，由于一时慌张，竟说成了“公鸡叫天都”。老师不慌不忙地写出“公鸡叫天都”，“不对，不对！应该是‘金鸡叫天都’”口快的同学大叫起来。老师随即用黄粉笔写上“金”。“同样的奇石，我们用了两个不同的名字来命名，哪个名字更适合这奇石呢？”同学们不约而同地回答“金鸡叫天都。”“为什么用‘金鸡’而不用‘公鸡’，你们从哪里看出来的呢？”于是，同学们又开始仔细阅读，并从“金光闪闪”、“雄鸡”、“每当太阳升起”等处找到了理由。

由此可见，通过巧妙的点化，这些“错误”成为了教学的最佳切入点，学生在争中分析、争中内化知识，他们的思辩能力得到了发展，从而为课堂的动态生成创造出意想不到的“美丽”。

四、利用列错纠错，提高反思能力

建构主义学习观认为，学生的错误必须是一个“自我否定”的过程，而“自我否定”又以自我反省作为必要的前提。利用学生的错误这一资源，就能引发这种“观念冲突”，促使他们有批判性的再思考。

一位老师教学《小露珠》时，发现许多学生把“草秆”写成“草杆”。显然，是由于学生对“秆”“杆”两字的读音和意义模糊不清，造成混淆了。利用这个错误资源，老师引导比较“秆”“竿”“杆”三个字。学生观察、比较、分析，还动手查字典，终于弄清三个字的区别，明白“竿”是用竹子做的，所以是竹字头；“秆”是指高粱、玉米等草本类植物的茎，所以是禾字旁；而“杆”是指用木头或水泥等制成的，所以是木字旁。

在这里，“错误”已成为点燃学生智慧火花的火种。通过找错、议错、改错的反思过程，既加深了学生对知识的理解和掌握，又提高了他们的分析反思能力，可谓一举两得。

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【关键词】医学分子生物学;教;课程设置

【中图分类号】G424 【文献标识码】B 【文章编号】1006-1959(2009)10-0245-02

分子生物学是研究生物大分子的结构、功能及基因结构、表达与调控的科学,从分子水平探讨生命现象的本质。医学分子生物学是研究人体在正常和疾病状态下生命活动及其规律,从分子水平开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的一门科学。分子生物学已成为生命科学领域的重要基础学科和前沿学科,广泛渗透到医学各学科领域,推动了医学各学科的发展,使医学科学从宏观到微观,从整体、细胞水平逐步进入了分子水平。医学各专业的学生,有必要很好地学习有关分子生物学基础理论,掌握必要的分子生物学实验技术,了解当今分子生物学的研究进展。加强医学分子生物学的教学,对培养具有广博知识的复合型医学高级人才具有及其重要的意义。近几年来,我们对医学分子生物学的教学进行了一些探索,取得较好的效果,积累了一些经验,特总结如下。

1 优化课程设置

医学教育的特点决定了医学分子生物学不同于综合性大学、农林、师范院校的课程,医学分子生物学偏重于与临床的结合,但又不能忽略基础知识的强化。正确处理分子生物学基础和临床应用的教学是解决医学分子生物学教学的关键[1]。为了和生物化学教学内容衔接,本课程不再讲授基因信息传递,仅讲授基因组的结构与功能,补充介绍网络生物信息资源。着重介绍分子生物学的基本技术和新技术,如PCR和各种衍生的PCR技术、DNA序列测定、分子杂交、基因工程、基因芯片等,并兼顾介绍一些新的技术如RNAi等。联系临床介绍癌基因与抑癌基因、基因诊断与基因治疗等。教师结合自身的科研经历展开授课,使课堂教学生动,给学生留下的印象深刻,让学生学有所获、学有所乐。

分子生物学是一门技术性很强的学科,如果只学习理论知识而不做实验,往往如空中楼阁,不知所云[2]?在坚持医学分子生物学理论教学的同时,通过开设相关实验将理论教学与实践操作有机结合,有助于加深对医学分子生物学理论的理解,增强学生的动手能力,使学生在教学过程中体会到所学知识的应用价值,提高学生的学习兴趣。我们在保证总课时36学时不变的情况下,调整了教学时数的分配,压缩理论课时,增加实验课时。将理论课由28学时减少到18学时,实验课由8h增加到18学时。将教师的科研成果应用于实践教学中,利用获得的重组DNA克隆作为实验材料,连续开设了质粒DNA的提取、感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和筛选、核酸的体外扩增、DNA的琼脂糖凝胶电泳共六个实验。在实验中着重介绍每个技术的原理和应用,利用实验步骤中间隔的等待时间讲解一些背景知识和需要补充的理论知识,使实验课内容充实而饱满。实验完成后进行总结,分析成功的经验和存在的问题,找到实验失败的可能原因,有利于学生学习知识和积累经验,为今后的临床及科研工作奠定基础。

2 开展双语教学

双语教学是我国高等教育与国际接轨,迎接新世纪挑战和教育改革发展的必然趋势,也是当前教学改革的重点和热点[3]。分子生物学进展极为迅速,其中大多数信息储存在英文资料和文献中,如果采用英文资料和课件进行讲授,学生可更准确的把握其含义,并且可及时获得分子生物学的最新进展,有助于高素质复合型高素质人才的培养。我们在参考相关专业教材的基础上,选定了DNA序列测定、核酸分子杂交、PCR三章内容进行了双语教学,制作了中文和英文两个课件,教师采用英文课件授课,学生利用中英文两个课件进行复习,使学生既掌握了基本技术,又强化了自身的英文水平,教师的整体教学水平也得到了提高。

3 完善考核体系

考试是督促学生学习的一个重要手段,考试目的是检测教育教学的效果。医学分子生物学是一门专业限选课,由于课时少,内容多,进展快,学生学习存在一定困难,有些学生并未引起足够的重视。如果只注重闭卷考试,会导致学生死记教材,不注重查阅文献和了解新进展,达不到创新性教育的目的。如果完全放弃闭卷考试,有些学生会放松对基本理论的学习,也达不到掌握基本知识和基本技能的效果[4]。为此,我们结合课程的教学特点,制订了闭卷考试、实践考核与撰写综述相结合的医学分子生物学考核方案,规定闭卷考试成绩总成绩的70% ,文献综述占10% ,实验成绩占15%,平时成绩占5%,将培养学生动手能力和思维能力全面地体现在考核成绩中。并且在第一次开课就提出课程的考核方式和考核要求,让学生在学习上引起足够的重视。为防止学生直接下载或复印别人的同类文章,教师限定写作内容,稿件一律用手写,并附5篇以上文献(含英文文献2篇以上),抄袭稿件计零分。这种综合考核方式使学生既能掌握医学分子生物学的知识体系,又能准确把握医学分子生物学的脉络和发展动态,熟悉互联网资源的查询和利用,提高了学生的文献查阅能力和英语水平,从而改变学生“读死书、死读书”的现状。

经过几年的教学探索,我们积累了一些教学经验,初步建立了一套适于医学生的医学分子生物学教学体系,收到了较好的教学效果。当然,现有的教学中仍存在一些不足,需要进一步开展教学改革。我们将充分利用多媒体教学资源,扩大双语教学内容,不断丰富和更新教学体系,创新教学手段,增加分子生物学软件使用的培训,适当介绍国内外最新理论和技术,紧跟分子生物学不断发展的步伐,以提高学生综合素质为目的,逐步提高教学质量。

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关键词：分子生物学；多元获取；教学改革

中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2015）12-0101-02

分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征和相互关系，从分子水平阐明生命现象与生命本质的学科。自Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型标志着人类对生命现象本质的认识进入到分子水平，分子生物学已成为现代生命科学的共同语言和人类由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科，同时也使得分子生物学称为现代生物学领域里最具活力的科学。（朱玉贤，2013）上世纪90年代以来，国内各高校先后为本科生开设了分子生物学课程，目的是引导学生从分子水平认识生命本质，了解有关分子生物学的基本理论知识和研究方法，为学习生命科学相关专业的学生进一步的学习和科研打下良好的分子生物学基础。在分子生物学的教学过程中，由于分子生物学课程知识体系庞杂，知识点多而分散，我们发现，对许多抽象的概念或原理的解释和阐述一直是教师的教学和学生的理解和掌握过程中存在的难题，上完课后同学们的普遍反应是晦涩难懂，犹如听天书一般；而且，分子生物学课程对实验技能和实验条件要求较高，实验涉及的内容也较为复杂，这就要求同学们不仅具备坚实的理论基础，还需具有非常强的实验动手能力；同时，分子生物学作为一门新兴学科，新理论、新技术层出不穷，知识更新快，更新周期也越来越短，这些研究方法的不断创新和理论体系的不断更新与完善更给分子生物学教学带来了极大挑战。怎样将分子生物学中晦涩的知识点转化为直观、浅显易懂的故事呈现在同学面前？怎样将理论与实验结合，使同学们从实验过程中领会各种生物大分子形态结构与功能的关系？怎样调动同学们对微观生命奥秘探索的兴趣，激发同学们的创新潜能，从而实现对生命科学创新人才的培养？作为湖南省精品课程，《分子生物学》教学一线的老师们尝试了一系列的教学改革和课程体系优化，致力于将分子生物学知识的传播由教师的单向传授为主转变为学生对分子生物学知识的多元获取，以着重培养学生的实验动手能力并激发学生的创新意识和科研能力。

一、基础知识和学科进展的有机结合

分子生物学诞生以来，作为生命科学的带头学科，学科发展极为迅速并渗透生命学科各个领域，但主要遗传物质DNA的双螺旋结构和“中心法则”提出至今未受到质疑。（胡剑，2014）在经典核心理论的基础上，对于基因表达调控以及信息传递通路等认识的不断丰富，以及从基因组、转录组、蛋白组、代谢组等水平上对生命现象和规律的理解逐步深入，要求我们在教学中一方面满足学生掌握分子生物学基本理论的需要，另一方面要适时地更新教学内容，充分调动学生的学习积极性，通过文献阅读、专题讲座和学术报告等途径获取最新知识，了解最新动态。在基础理论知识的讲解的过程中，尽量将课本上相关的一些分散知识系统化并提炼出知识点，指导学生在理解的基础上，采用总结规律性的方式帮助记忆。文献阅读的内容则选择来自《Cell》、《Nature》、《Plant cell》、《Plant journal》、《Plant physiology》、《Science》等权威期刊的最新研究论文或研究综述，通过在线查阅，翻译和研读的方式将分子生物学领域的最新研究进展展现在大家面前，既让同学们了解了本领域的最新进展，也教会了同学们查阅文献的方法。这种“基础知识”和“学科进展”的有机整合方式，同学们的主动学习积极性被激发；文献资料搜集和自主学习能力得到提高，学生的创新意识和从事科学研究的能力得到培养，同时也形成了同学们对不断发展的分子生物学知识多方位丰富的理解。

二、讨论交流在教学中的应用

分子生物学内容与生命活动息息相关，讲到热点话题时自然会激起同学们之间的讨论与交流的兴趣。多年的教学经验证明，在分子生物学教学中应适当增加课堂讨论与交流的教学方式，既能启发学生的学习兴趣，又能提高同学们的思考能力和口头表达能力。因为这种讨论与交流教学，强调在教师的精心准备和指导下，教师作为“导演”，对学生的思维加以引导和启发，并通过预先的设计与组织，来启发学生就特定问题发表自己的见解；学生则是在教师指导下进行有意识的思维探索活动，学生的学习始终处于“问题―思考―探索―解答”的积极状态。事实上，分子生物学可供讨论的题材很多：如超级细菌是如何产生的？表观信号如何影响性状？细胞衰老死亡的调控是如何进行的？转基因食品的利与弊；癌基因，抑癌基因和癌症的发生分子机制；细胞重编码的分子机制；等等。对这些热点问题的讨论培养了学生诸多方面的能力：提高了学生的学习兴趣，培养了学生的自学能力，促进了师生交流与沟通，培养了学生的口头表达能力，增强了同学们的团队合作能力。同时，由于学生看问题的方法不同，会从各个角度、各个侧面来揭示基本概念的内涵和基本规律的实质，从而产生自主性、探索性和协同性的学习。

三、动画、微课、精品资源库等教学网络资源的整合

分子生物学是一门内容丰富、应用性超强的学科，板书、挂图、模型和幻灯片等传统的教学手段远不能传递和表达繁多而抽象的分子生物学内容，更无法让学生深入理解抽象的教学内容。而动画、微课和精品资源库等网络多媒体教学资源的应用很大程度上解决了这一难点，使得抽象复杂的内容在多媒体教学中更加简单化、直观化和具体化，同学们也更容易理解分子生物学。如DNA复制和转录、蛋白质的生物合成、乳糖操纵子模型、衰减子模型，转座位子模型，DNA重组Holliday模型都可制作成微课，以动画和微课模式展示在同学面前，利用动画和微课等直观、生动和主题鲜明的特点帮助同学理解。

四、理论与实验结合模式的运用

分子生物学是一门实验性特别强的学科，分子生物学实验是基础理论课的配套课程，是理论教学的深化和补充，与理论课密不可分，在课程设置中占有重要的地位。但是，分子生物学实验条件要求相对比较高，使得学生对于分子生物学实验内容和方法有非常大的畏惧心理。针对学生的这种恐惧心理，我们合理安排实验内容，并加大了实验课程的比重。为了让学生由浅入深逐步认识分子生物学常规技术，除了常规的每周4节课的实验课程外，我们还安排了分子生物学综合实验周、将质粒提取、电泳检测、基因克隆、载体构建、酶切鉴定等方面的实验技术集中在实验周内进行，以便更系统地将DNA重组相关的实验技术传授给学生，并在条件允许的情况下尽可能的把新的实验技术手段介绍给学生。对分子生物学课程特别感兴趣的同学，我们还鼓励学生参与到教师的科研工作中去，利用现有的科研条件，引导学生思考并完成相关的实验内容，以培养学生的创新思维和发现问题、分析问题和解决问题的能力，从而使学生的科学素养和科研能力得到较高的提升。

五、教学师资的内涵建设与发展

作为当前生命科学中发展最快并与其他学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域，分子生物学发展的突飞猛进和分子生物学技术发展的日新月异给分子生物学的课程教学带来极大的挑战。在分子生物学教学过程中，为适应时展的高层次和高素质人才培养的需要，为了使分子生物学课堂更加具有吸引力，作为教师更应该对最新的研究热点有敏锐的洞察力，因而教师自身专业素质对教学质量的提升和对学生的专业知识学习兴趣的培养起着至关重要的作用。提高教师自身素质，加强教学师资的内涵建设与发展，我们主要从三方面着手：（1）实施以老带新，为青年教师配备导师的制度和每周一次的教学讨论，通过老师之间的经验交流，相互学习和取长补短，以期共同提高授课水平和教学能力；（2）通过在职培养、外出进修和人才引进等并举的方式壮大师资力量。在职攻读博士学位的方式加强青年教师知识结构的优化；国内外访学计划则拓宽了中青年教师视野；人才引进则增强了提高教师专业素养和学术水平；（3）通过主持或参与产学研团队的各级教改和科研项目，提高教师自身的创新意识和科研素养，并渗透到教学之中，给学生以更多的启迪和思考。

2010年以来开展的《分子生物学》教学实践改革证明，多元获取教学模式在分子生物学教学中的应用，提高了教与学的效率，促进了老师和学生的互动，教与学相得益彰，取得了较好的教学效果。

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