基因组学研究精选(五篇)

序言：作为思想的载体和知识的探索者，写作是一种独特的艺术，我们为您准备了不同风格的5篇基因组学研究，期待它们能激发您的灵感。

篇1

药物基因组学是伴随人类基因组学研究的迅猛发展而开辟的药物遗传学研究的新领域，主要阐明药物代谢、药物转运和药物靶分子的基因多态性及药物作用包括疗效和毒副作用之间关系的学科。

基因多态性是药物基因组学的研究基础。药物效应基因所编码的酶、受体、离子通道作为药物作用的靶，是药物基因组学研究的关键所在。基因多态性可通过药物代谢动力学和药物效应动力学改变来影响物的作用。

基因多态性对药代动力学的影响主要是通过相应编码的药物代谢酶及药物转运蛋白等的改变而影响药物的吸收、分布、转运、代谢和生物转化等方面。与物代谢有关的酶有很多，其中对细胞色素-P450家族与丁酰胆碱酯酶的研究较多。基因多态性对药效动力学的影响主要是受体蛋白编码基因的多态性使个体对药物敏感性发生差异。

苯二氮卓类药与基因多态性：咪唑安定由CYP3A代谢，不同个体对咪唑安定的清除率可有五倍的差异。地西泮是由CYP2C19和CYP2D6代谢，基因的差异在临床上可表现为用药后镇静时间的延长。

吸入与基因多态性：RYR1基因变异与MH密切相关，现在已知至少有23种不同的RYR1基因多态性与MH有关。氟烷性肝炎可能源于机体对在CYP2E1作用下产生的氟烷代谢产物的一种免疫反应。

神经肌肉阻滞药与基因多态性：丁酰胆碱酯酶是水解琥珀酰胆碱和美维库铵的酶，已发现该酶超过40种的基因多态性，其中最常见的是被称为非典型的（A）变异体，与用药后长时间窒息有关。

镇痛药物与基因多态性：μ-阿片受体是阿片类药的主要作用部位，常见的基因多态性是A118G和G2172T。可待因和曲马多通过CYP2D6代谢。此外，美沙酮的代谢还受CYP3A4的作用。儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)基因与痛觉的产生有关。

局部与基因多态性：罗哌卡因主要由CYP1A2和CYP3A4代谢。CYP1A2的基因多态性主要是C734T和G2964A，可能影响药物代谢速度。

一直以来麻醉科医生较其它专业的医疗人员更能意识到不同个体对药物的反应存在差异。的药物基因组学研究将不仅更加合理的解释药效与不良反应的个体差异，更重要的是在用药前就可以根据病人的遗传特征选择最有效而副作用最小的药物种类和剂型，达到真正的个体化用药。

能够准确预测病人对麻醉及镇痛药物的反应，一直是广大麻醉科医生追求的目标之一。若能了解药物基因组学的基本原理，掌握用药的个体化原则，就有可能根据病人的不同基因组学特性合理用药，达到提高药效，降低毒性，防止不良反应的目的。本文对药物基因组学的基本概念和常用的药物基因组学研究进展进行综述。

一、概述

二十世纪60年代对临床麻醉过程中应用琥珀酰胆碱后长时间窒息、硫喷妥钠诱发卟啉症及恶性高热等的研究促进了药物遗传学（Pharmacogenetics）的形成和发展,可以说这门学科最早的研究就是从麻醉学开始的。

药物基因组学(Phamacogenomics)是伴随人类基因组学研究的迅猛发展而开辟的药物遗传学研究的新领域，主要阐明药物代谢、药物转运和药物靶分子的基因多态性及药物作用包括疗效和毒副作用之间的关系。它是以提高药物的疗效及安全性为目标，研究影响药物吸收、转运、代谢、消除等个体差异的基因特性，以及基因变异所致的不同病人对药物的不同反应，并由此开发新的药物和用药方法的科学。

1959年Vogel提出了“药物遗传学”,1997年Marshall提出“药物基因组学”。药物基因组学是药物遗传学的延伸和发展，两者的研究方法和范畴有颇多相似之处，都是研究基因的遗传变异与药物反应关系的学科。但药物遗传学主要集中于研究单基因变异，特别是药物代谢酶基因变异对药物作用的影响；而药物基因组学除覆盖药物遗传学研究范畴外，还包括与药物反应有关的所有遗传学标志，药物代谢靶受体或疾病发生链上诸多环节，所以研究领域更为广泛[1,2,3]。

二、基本概念

1．分子生物学基本概念

基因是一个遗传密码单位，由位于一条染色体(即一条长DNA分子和与其相关的蛋白)上特定位置的一段DNA序列组成。等位基因是位于染色体单一基因座位上的、两种或两种以上不同形式基因中的一种。人类基因或等位基因变异最常见的类型是单核苷酸多态性(single-nucleotidepolymorphism,SNP)。目前为止，已经鉴定出13000000多种SNPs。突变和多态性常可互换使用，但一般来说，突变是指低于1%的群体发生的变异，而多态性是高于1%的群体发生的变异。

2．基因多态性的命名法：

(1)数字前面的字母代表该基因座上最常见的核苷酸(即野生型)，而数字后的字母则代表突变的核苷酸。例如：μ阿片受体基因A118G指的是在118碱基对上的腺嘌呤核苷酸(A)被鸟嘌呤核苷酸(G)取代，也可写成118A/G或118A>G。

(2)对于单个基因密码子导致氨基酸转换的多态性编码也可以用相互转换的氨基酸的来标记。例如：丁酰胆碱酯酶基因多态性Asp70Gly是指此蛋白质中第70个氨基酸－甘氨酸被天冬氨酸取代。

三、药物基因组学的研究内容

基因多态性是药物基因组学的研究基础。药物效应基因所编码的酶、受体、离子通道及基因本身作为药物作用的靶，是药物基因组学研究的关键所在。这些基因编码蛋白大致可分为三大类:药物代谢酶、药物作用靶点、药物转运蛋白等。其中研究最为深入的是物与药物代谢酶CYP45O酶系基因多态性的相关性[1,2,3]。

基因多态性可通过药物代谢动力学和药物效应动力学改变来影响药物作用，对于临床较常用的、治疗剂量范围较窄的、替代药物较少的物尤其需引起临床重视。

（一）基因多态性对药物代谢动力学的影响

基因多态性对药物代谢动力学

的影响主要是通过相应编码的药物代谢酶及药物转运蛋白等的改变而影响药物的吸收、分布、转运、代谢和生物转化等方面[3,4,5,6]。

1、药物代谢酶

与物代谢有关的酶有很多，其中对细胞色素-P450家族与丁酰胆碱酯酶的研究较多。

（1）细胞色素P-450（CYP45O）

物绝大部分在肝脏进行生物转化，参与反应的主要酶类是由一个庞大基因家族编码控制的细胞色素P450的氧化酶系统，其主要成分是细胞色素P-450（CYP45O）。CYP45O组成复杂，受基因多态性影响，称为CYP45O基因超家族。1993年Nelson等制定出能反应CYP45O基因超家族内的进化关系的统一命名法：凡CYP45O基因表达的P450酶系的氨基酸同源性大于40%的视为同一家族（Family），以CYP后标阿拉伯数字表示，如CYP2；氨基酸同源性大于55%为同一亚族（Subfamily），在家族表达后面加一大写字母，如CYP2D；每一亚族中的单个变化则在表达式后加上一个阿拉伯数字，如CYP2D6。

（2）丁酰胆碱酯酶

麻醉过程中常用短效肌松剂美维库铵和琥珀酰胆碱，其作用时限依赖于水解速度。血浆中丁酰胆碱酯酶(假性胆碱酯酶)是水解这两种药物的酶，它的基因变异会使肌肉麻痹持续时间在个体间出现显著差异。

2、药物转运蛋白的多态性

转运蛋白控制药物的摄取、分布和排除。P-糖蛋白参与很多药物的能量依赖性跨膜转运，包括一些止吐药、镇痛药和抗心律失常药等。P-糖蛋白由多药耐药基因（MDR1）编码。不同个体间P-糖蛋白的表达差别明显，MDR1基因的数种SNPs已经被证实，但其对临床麻醉的意义还不清楚。

（二）基因多态性对药物效应动力学的影响

物的受体（药物靶点）蛋白编码基因的多态性有可能引起个体对许多药物敏感性的差异，产生不同的药物效应和毒性反应[7,8]。

1、蓝尼定受体-1（Ryanodinereceptor-1，RYR1）

蓝尼定受体-1是一种骨骼肌的钙离子通道蛋白，参与骨骼肌的收缩过程。恶性高热（malignanthyperthermia,MH）是一种具有家族遗传性的、由于RYR1基因异常而导致RYR1存在缺陷的亚临床肌肉病，在挥发性吸入和琥珀酰胆碱的触发下可以出现骨骼肌异常高代谢状态，以至导致患者死亡。

2、阿片受体

μ-阿片受体由OPRM1基因编码，是临床使用的大部分阿片类药物的主要作用位点。OPRM1基因的多态性在启动子、内含子和编码区均有发生，可引起受体蛋白的改变。吗啡和其它阿片类药物与μ-受体结合而产生镇痛、镇静及呼吸抑制。不同个体之间μ-阿片受体基因的表达水平有差异，对疼痛刺激的反应也有差异，对阿片药物的反应也不同。

3、GABAA和NMDA受体

γ-氨基丁酸A型（GABAA）受体是递质门控离子通道，能够调节多种物的效应。GABAA受体的亚单位（α、β、γ、δ、ε和θ）的编码基因存在多态性（尤其α和β），可能与孤独症、酒精依赖、癫痫及精神分裂症有关，但尚未见与物敏感性有关的报道。N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体的多态性也有报道，但尚未发现与之相关的疾病。

（三）基因多态性对其它调节因子的影响

有些蛋白既不是药物作用的直接靶点，也不影响药代和药效动力学，但其编码基因的多态性在某些特定情况下会改变个体对药物的反应。例如，载脂蛋白E基因的遗传多态性可以影响羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂（他汀类药物）的治疗反应。鲜红色头发的出现几乎都是黑皮质素-1受体（MC1R）基因突变的结果。MC1R基因敲除的老鼠对的需求量增加。先天红发妇女对地氟醚的需要量增加，热痛敏上升而局麻效力减弱。

四、苯二氮卓类药与基因多态性

大多数苯二氮卓类药经肝脏CYP45O代谢形成极性代谢物，由胆汁或尿液排出。常用的苯二氮卓类药物咪唑安定就是由CYP3A代谢，其代谢产物主要是1-羟基咪唑安定，其次是4-羟基咪唑安定。在体实验显示不同个体咪唑安定的清除率可有五倍的差异。

地西泮是另一种常用的苯二氮卓类镇静药，由CYP2C19和CYP2D6代谢。细胞色素CYP2C19的G681A多态性中A等位基因纯合子个体与正常等位基因G纯合子个体相比，地西泮的半衰期延长4倍，可能是CYP2C19的代谢活性明显降低的原因。A等位基因杂合子个体对地西泮代谢的半衰期介于两者之间。这些基因的差异在临床上表现为地西泮用药后镇静或意识消失的时间延长[9,10]。

五、吸入与基因多态性

到目前为止，吸入的药物基因组学研究主要集中于寻找引起药物副反应的遗传方面的原因，其中研究最多的是MH。药物基因组学研究发现RYR1基因变异与MH密切相关，现在已知至少有23种不同的RYR1基因多态性与MH有关。

与MH不同，氟烷性肝炎可能源于机体对在CYP2E1作用下产生的氟烷代谢产物的一种免疫反应，但其发生机制还不十分清楚[7,11]。

六、神经肌肉阻滞药与基因多态性

神经肌肉阻滞药如琥珀酰胆碱和美维库铵的作用与遗传因素密切相关。血浆中丁酰胆碱酯酶(假性胆碱酯酶)是一种水解这两种药物的酶，已发现该酶超过40种的基因多态性，其中最常见的是被称为非典型的（A）变异体，其第70位发生点突变而导致一个氨基酸的改变，与应用肌松剂后长时间窒息有关。如果丁酰胆碱酯酶Asp70Gly多态性杂合子(单个等位基因)表达，会导致胆碱酯酶活性降低，药物作用时间通常会延长3～8倍；而丁酰胆碱酯酶Asp70Gly多态性的纯合子(2个等位基因)表达则更加延长其恢复时间，比正常人增加60倍。法国的一项研究表明，应用多聚酶链反应（PCR）方法，16例发生过窒息延长的病人中13例被检测为A变异体阳性。预先了解丁酰胆碱酯酶基因型的改变，避免这些药物的应用可以缩短术后恢复时间和降低医疗费用[6,12]。

七、镇痛药物与基因多态性

μ-阿片受体是临床应用的阿片类药的主要作用部位。5%～10%的高加索人存在两种常见μ-阿片受体基因变异，即A118G和G2172T。A118G变异型使阿片药物的镇痛效力减弱。另一种阿片相关效应—瞳孔缩小，在118G携带者明显减弱。多态性还可影响阿片类药物

的代谢。

阿片类药物的重要的代谢酶是CYP2D6。可待因通过CYP2D6转化为它的活性代谢产物－吗啡，从而发挥镇痛作用。对33名曾使用过曲马多的死者进行尸检发现，CYP2D6等位基因表达的数量与曲马多和O－和N－去甲基曲马多的血浆浓度比值密切相关，说明其代谢速度受CYP2D6多态性的影响。除CYP2D6外，美沙酮的代谢还受CYP3A4的作用。已证实CYP3A4在其它阿片类药如芬太尼、阿芬太尼和苏芬太尼的代谢方面也发挥重要作用。

有报道显示儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)基因与痛觉的产生有关。COMT是儿茶酚胺代谢的重要介质，也是痛觉传导通路上肾上腺素能和多巴胺能神经的调控因子。研究证实Val158MetCOMT基因多态性可以使该酶的活性下降3～4倍。Zubieta等报道，G1947A多态性个体对实验性疼痛的耐受性较差，μ-阿片受体密度增加，内源性脑啡肽水平降低[13～16]。

八、局部与基因多态性

罗哌卡因是一种新型的酰胺类局麻药，有特有的S-(-)-S对应体，主要经肝脏代谢消除。罗哌卡因代谢产物3-OH-罗哌卡因由CYP1A2代谢生成，而4-OH-罗哌卡因、2-OH-罗哌卡因和2-6-pipecoloxylidide(PPX)则主要由CYP3A4代谢生成。CYP1A2的基因多态性主要是C734T和G2964A。Mendoza等对159例墨西哥人的DNA进行检测，发现CYP1A2基因的突变率为43%。Murayama等发现日本人中CYP1A2基因存在6种导致氨基酸替换的SNPs。这些发现可能对药物代谢动力学的研究、个体化用药具有重要意义[17,18,19]。

九、总结与展望

篇2

关键词：药物基因组学；中药；基因组技术

中图分类号：[R932] 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2013）44-0160-02

中药是中华民族的瑰宝，随着生物科技的发展，我们也越来越关注运用现代科学技术对中药进行全面研究。基因组学是20世纪末发展起来的一门科学，随着人类基因组计划的完成及后基因组时代的到来，药物基因组（Pharmacogenomics），即研究遗传变异与药物反应相互关系的一门学科，是以提高药物的疗效和安全为目标，已成为新的研究重点。药物基因组学的发展为中药现代化提供了良好契机。

一、基因组学概述

1.基因组学定义。基因组学（Genomics）是研究基因组的科学，它以分子生物学、电子计算机和信息网络技术为研究手段，以生物体内全部基因为研究对象，在全基因组背景下和整体水平上探索生命活动内在规律及内在环境对机体影响机制的科学。它从全基因组的整体水平，而不是单个水平，来研究生命这一具有自组织和自装配特性的复杂系统，认识生命活动的规律，从而将更加接近生命的本质和面貌。

2.基因组研究内容。基因组学作为一门新兴学科，根据其研究对象，研究的重点及研究的目的不同，又分成多分支学科。根据研究的重点不同，基因组学可以分为结构基因组学和功能基因组学，结构基因组学以全基因组测序为目标，而功能基因组学以基因功能鉴定为目标。根据研究的对象不同还可将基因组学分为疾病基因组学、比较基因组学、药物基因组学和环境基因组学等。基因组研究可以理解为：①基因表达概况研究，即比较不同组织和不同发育阶段、正常状态与疾病状态，以及体外培养的细胞中基因表达模式的差异，技术包括传统的RTPCR，RNase保护试验，RNA印迹杂交等。②基因产物-蛋白质功能研究，包括单个基因的蛋白质体外表达方法，以及蛋白质组研究。③蛋白质与蛋白质相互作用的研究，利用酵母双杂交系统，单杂交系统（one-hybrid system），三杂交系统（thrdee-hybrid system）以及反向杂交系统（reverse hybrid system）等。

二、中药研究中常用的基因组技术

1.基因芯片技术。基因芯片又称DNA芯片（DNA chip）、DNA微阵列，是基于核酸、探针互补杂交技术原理，将大量的寡核酸片段按预先设定的排列顺序固化在载体表面如硅片或玻片上，并以此为探针，在一定的条件下与样品中的待测的靶基因片段或DNA序列杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来实现对靶序列信息的快速检测和分析。目前已成为基因表达分析的最常用工具。基因芯片技术具有高通量、并行、高内涵的特点，这就为探索中药作用机理开辟了新领域。现代药理学分子水平研究表明药物作用都有其靶点，基因芯片可以确定靶组织的基因表达模式，从而将中药作用的靶基因全部显示出来。如陈明伟利用基因芯片技术检测中药单体人参皂苷20（R）Rg3对肿瘤血管生长调控因子（VEGF）蛋白表达的抑制作用。基因芯片技术还有助于确定中药有效部位，通过基因芯片技术迅速筛选起作用的中药有效成分。此外，基因芯片技术在中药材鉴定，道地药材筛选，中药新药研发等方面都有重要的应用。

2.DNA分子标记技术。①RAPD技术。RAPD即随机扩增多态性DNA，在1990年由Welsh与Williams等人发展起来，是建立在PCR（Polymerase Chain Reaction）基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列（通常为10个碱基对）为引物，在热稳定的DNA聚合酶作用下，进行PCR扩增。RAPD技术能快捷地辨别出不同遗传物质之间最微小的DNA偏差，而且耗材较少，不必提前获知其基因碱基顺序，通过对遗传资源的分析，从遗传多样性中得到详尽的遗传信息。现在，RAPD技术已成功鉴定细辛、蒲公英、龙胆草、人参及西洋参等药材。②RELP技术。RELP技术即限制性长度多态性分析技术，就是将DN段用限制性内切酶消化后，进行限制性片段长度多态性分析。RELP技术可以确定基因种属的特异性和药材的鉴定。陈美兰采用PCR-RFLP方法从分子水平鉴定人参中有效成分人参皂苷的含量，克服了因人参分布易受生长环境、储存条件和加工等诸因素影响，采用传统的形态学和组织学方法难以鉴别的缺点。

3.PCR技术。PCR技术即聚合酶链式反应技术，是体外扩增DNA序列的技术，广泛应用于目的基因的制备等几乎所有的分子生物学领域。DNA的保存需要严格的条件，在正常的中药材加工和储存过程中是很难做到的。王严明等通过PCR技术从保存了9年的药材龟板中提取DNA，成功进行了DNA指纹鉴定。

4.DNA测序技术。DNA测序技术，即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。该技术包括单向测序（Single-Read Sequencing），双向测序（Paied-End Sequencing）混合样品测序（Indexed Sequencing）。DNA测序技术在中药品质研究中有重要的应用，刘玉萍等采用PCR直接测序技术测定半夏及其伪品的18SrRNA基因核苷酸序列并作序列变异和选择性内切酶谱（PCR-SR）分析，为半夏正品鉴别提供分子依据。此外，该技术还可以用于中药的品质鉴定，仇萍等通过DNA指纹图谱从分子水平对中药材种质进行准确分析，从而为鉴定药材的真伪优劣提供依据。

三、展望

基因组学研究已把揭示生命本质提高到了一个全新水平，同样它在中药各个领域的渗透也使中药发展有了更广阔的前景，将推动中药在种材培育、药材鉴定、机理阐述和新药研发的进步，促进中药走出中国，走向世界。

参考文献：

[1]侯灿.后基因组时代的统一医药学——展望21世纪复杂性科学的一个新前沿（一）[J].中国中西医结合，2002，22（1）：5-7.

[2]朱华，吴耀生.基因芯片技术在药用植物研究中的应用.中草药，2005，36（10）：144l-1444.

[3]荆志伟，王忠，高思华等.基因芯片技术与中药研究—中药基因组学[J].中国中药，2007，32（4）：289-292.

[4]陈明伟，倪磊，赵小革.人参皂苷R93对肿瘤血管生长调控因子蛋白表达抑制作用的研究[J].中国中药，2005，30（5）：357-360.

[5]侯敏芳.分子生物技术在中药鉴定中的应用[J].浙江中医药大学学报，2010，3（4）：120-130.

[6]陈美兰.采用RAPD和PCR-RFLP方法从分子水平鉴定人参[J].Biol Pharm Bull，2001，24（8）：872-875.

[7]王亚明，周亚光，吴平等.中药龟板和鳖甲中DNA的提取和扩增[J].药学学报，1996，31（6）：472-476.

篇3

关键词： 功能基因组； 西瓜； 甜瓜； 黄瓜

功能基因组学（functional genomics），又被称为后基因组学（post-genomics），它是利用结构基因组学提供的丰富信息和产物，借助高通量、大规模的试验分析方法，在全基因组或系统水平上研究基因的功能，弄清生物体中各组分是如何工作并形成有功能的细胞、组织及整个生物体[1]。其目标是明确基因组中全部基因的功能， 揭示植物生长发育、环境应答互作的分子网络， 从而全面阐释植物的生物学基础。目前，水稻、拟南芥等模式植物功能基因组学研究发展较快，近几年随着科技进步和资金投入的不断增加，葫芦科作物基因组研究也取得了一定的成果。西瓜基因组全长约425 Mb，甜瓜约450 Mb，黄瓜约376 Mb[2]， 基因组大小比较适合开展基因组测序和功能基因组研究。2007年由西班牙牵头组织，美国、中国、法国、以色列、日本等国家的14个实验室联合启动了国际葫芦科基因组计划（International Cucurbit Genomics Initiative，ICuGI），该计划为瓜类蔬菜的基因组学研究奠定了良好的技术平台。在此基础上，2008年相继启动了葫芦科三大作物西瓜、甜瓜、黄瓜的全基因组测序计划[3]。随着基因组测序工作的陆续完成，瓜类作物基因组研究逐步进入到功能基因组研究时代。本文综述了近些年植物功能基因组学主要研究方法在西瓜、甜瓜以及黄瓜上的应用概况。

1 高通量、大规模EST测序及功能解析

EST（Express Sequence Tag）是指通过对cDNA 文库中随机挑取的克隆进行大规模测序所获得的cDNA 的5’或3’端序列，长度一般为150～500 bp。EST是基因编码序列的一部分，通过与数据库中已知功能的基因序列进行对比，从理论上可推测其基因功能。EST已发展成为新基因发现的有效途径，也是植物功能基因组学研究的重要工具。随着测序技术的不断改良和测序成本的降低，高通量、大规模EST测序及功能解析开始广泛应用。

西瓜EST研究方面，A. Levi 等[4]通过与叶片cDNA消减杂交构建了西瓜果实发育不同时期（授粉后12、24、36 d）果肉消减cDNA文库，获得了832条无冗余EST，序列比对分析表明有410个EST-unigenes与已知编码蛋白的基因同源，按功能归类分属于初级代谢、氨基酸合成组装、细胞膜运输、细胞分裂、细胞壁代谢、细胞骨架和细胞形成、基因转录和表达、信号转导、抗性防御和次级代谢。这些潜在的功能基因序列为日后开展西瓜果实发育和品质形成的遗传与功能基因组研究奠定了基础。吕桂云等[5]通过构建枯萎病菌诱导的西瓜根系组织SSH-cDNA文库，对测序获得的4 431条高质量EST序列进行聚类拼接，获得1 756个非重复序列，基因功能分类表明抗病与防御相关基因约占36.3%，对获得的西瓜与枯萎病非亲和互作中部分特异性表达的基因进行了初步探讨，发现可能参与西瓜与枯萎病菌非亲和互作的转录因子、激酶和防卫基因及茉莉酸和木质素2个主要代谢途径。Guo等[6]采用Roche/454新一代测序技术，从西瓜4个果实发育期（授粉后10、18、26、34 d）获得了577 023个高质量EST，组装成了75 068个unigenes，有54.9% 的unigenes与GeneBank中的已知基因同源，其中2/3来源于黄瓜。Gene Ontology （GO）注释表明，有33 853个unigenes（45.1%）获得至少1个GO术语，被注释序列的基因功能分属于分子功能（molecular function）类别、生物过程（biological process）类别和细胞组分（cellular component）类别，所占比例分别为38.6%、38.6%和36%，另外大约29%的unigenes同时具有以上3种功能分类。生物过程类别的基因主要参与细胞过程、代谢过程和生物合成过程，表明果肉组织在发育过程中发生了广泛的代谢活动。数字基因表达谱分析及实时定量PCR验证表明有3 023个基因在果实发育不同时期存在显著的表达差异，表达量差异至少在2倍以上。研究发现细胞壁相关基因在未成熟白瓤果肉组织中高效表达，而类葫芦卜素代谢基因（八氢番茄红素合成酶和番茄红素-β环化酶）、蔗糖代谢基因（蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶）在果实发育不同时期差异表达明显，作者对与果实品质相关的一些生化途径如纤维素合成、木栓质合成、葡萄糖合成降解以及淀粉合成降解等进行了进一步鉴定。

甜瓜大规模EST测序及功能解析方面，Nurit Katzir等[7]通过构建甜瓜EST数据库，从4 800条序列中鉴定出与甜瓜果实香味代谢相关的3类基因家族，乙醇乙酰转移酶、倍半萜合酶和类胡萝卜素裂解双加氧酶，克隆得到候选基因的全长序列，研究了这些基因在不同甜瓜品种间的表达模式。Daniel Gonzalez-Ibeas等[8]通过对8个来源于甜瓜不同组织和生理状态的cDNA文库（包括授粉后15 d和46 d的2个果实的文库）测序和序列拼接、组装，获得16 637个无冗余EST。通过与拟南芥基因组做生物信息学比对分析，发现众多个与果实发育相关的基因，如ACC合成酶、ACC氧化酶、细胞壁代谢酶、类胡萝卜素合成代谢酶、MADS-box 基因等。实时定量PCR表明在果实成熟期乙烯受体基因EIN4表达量翻倍，表明该基因与果实成熟期乙烯信号调控相关。MADS-box 基因SVP在果实成熟期表达量下降了4倍，番茄红素ε环化酶基因（LUT2）和木葡聚糖内糖基转移酶基因（TCH4）表达量也下降了4倍。2011年，Christian Clepet等[9]构建了4个不同类型甜瓜品种不同植物组织的11个全长cDNA文库和4个标准化cDNA文库，分别获得71 577 条和22 179条EST，能够组装成24 444条unigenes，基因对比显示有75%～85%的序列与双子叶植物同源，70%与单子叶植物同源，有6 972个基因家族在双子叶植物和单子叶植物间具有保守性。对数字基因表达谱研究，结果表明有175个基因为组织特异表达，这些基因为未来开展功能基因组研究提供了宝贵的资源。作者从这些序列中鉴定出了4 068个SSR和3 073个SNP，并对1 382个全长转录组进行了分析。为了解甜瓜对盐胁迫的抗性反应机制，Shiwei Wei等[10]构建了耐盐甜瓜品种根系组织的抑制消减杂交（SSH）cDNA文库，测序获得262条uni-ESTs，有161条序列与已知基因高度同源，128条与未知功能基因同源，有很多基因显示与生物和非生物胁迫相关。研究表明，甜瓜耐盐受众多蛋白质调控，这些蛋白涉及细胞代谢、能量、转录、信号转导、蛋白质命运以及细胞拯救和防御等生物过程，表明甜瓜作物耐盐存在复杂的抗性反应机制。

在黄瓜上面，Dae-Jae Kim[11]构建了黄瓜子叶生长不同时期的cDNA文库，筛选出大量与衰老相关的基因，利用半定量RT-PCR分析了365个克隆，发现有很多基因表达量提高，这些基因有些功能已知，有些功能未知。齐晓花等[12]采用SMART 技术构建了高抗白粉病的黄瓜品系JIN5-508 的叶片cDNA文库，利用该文库随机挑选的8 352个克隆从5’端进行单向测序，共获得8 035个有效的ESTs，序列的平均长度为838 bp。从文库中筛选出了大量的低丰度表达基因，约占unigene总数的72.5%，1 991个unigenes 获得分子功能注释，其中与蛋白结合活性和催化活性相关的基因分别达到了41.34%和38.72%；在获得功能注释的unigene 中，有部分抗病抗逆相关基因高丰度表达，其中3个unigenes与拟南芥白粉病抗性基因Mlo2、Mlo8 和Mlo14 高度同源。盛慧等[13]利用抑制性消减杂交技术（SSH）构建黄瓜胚胎发育早期和晚期差异表达cDNA文库，经反向Northern blot杂交检测，共得到97个阳性克隆。利用分子生物学软件对测序后的序列进行质量检测和聚类、拼接，共得到93个Uni-ESTs，其中包括86个singletons 和7个contigs。将上述EST序列在GenBank上进行BLAST比对，有83个EST片段找到了与之匹配的同源序列，有10 个EST片段未找到同源序列，推测可能是新基因。其中很多EST与拟南芥、水稻或玉米蛋白质数据库中的热激蛋白具有很高的同源性。将以上序列进行功能分类，发现在胚胎发育早期细胞防御和代谢过程占主要位置，而在胚胎发育晚期细胞防御和抗渗透胁迫功能是非常重要的。Guo等[14]以黄瓜全雌系和雌雄同株系测序获得353 941条EST，其中188 255条来源于全雌花，165 686条来源于雌雄花，结合5 600条GeneBank收录的EST和mRNA序列，组装成了81 401条unigenes。通过基因功能注释和分析，预测了343个生化代谢途径。对数字基因表达分析，表明大约200个基因在不同花性型存在差异表达，为研究植物花分化的分子机理提供了新的认识。潘宇等[15]构建了黄瓜授粉前后多个发育阶段的幼果组织cDNA文库，测序获得116条EST，92.2% 的长度在400 bp以上，19% 为重叠序列。在GeneBank中进行BLAST分析后确认与已知功能基因相似的EST序列有71条，有相似序列而功能未知的基因和没有相似序列的EST序列各占19.83% 和18.97%。

2 TILLING技术

TILLING（targeting induced local lesions in

genomes，定向诱导基因组局部突变技术），该技术借助高通量、标准化的检测手段，快速有效地从经化学诱变剂（EMS）诱变过的突变群体中鉴定出点突变。与传统的插入突变比，TILLING技术利用传统的化学诱变获得突变体，不需要耗时的转基因和复杂的组织培养过程，具有高通量、低成本、高效率等诸多优势。目前，TILLING作为一种全新的反向遗传学研究方法已经用于多种植物。

TILLING技术在葫芦科作物上的应用主要集中在甜瓜方面，2007年，Yaakov Tadmor等[16]最先用EMS诱变构建了甜瓜品种Noy Yizreel的突变基因库，共产生3 000个M2家系，发现了大量新的表型突变，大部分为隐性单基因控制。Fatima Dahmani-Mardas等[17]建立了甜瓜品种Char Mono （Cucumis melo L. subsp. melo var. cantalupensis）的TILLING技术平台，CharMono系雌雄同株、呼吸跃变型，在M2现了大量子叶、茎蔓、花和果实发生的表型突变，利用与果实品质相关的11个基因筛选突变株系，发现大约每隔573 kb会发生一个突变，大部分都是G/C 突变成 A/T ，也有G/C 到 C/G，T/A到 A/T和C/G到A/T的变异，外显子测序表明31.3%为基因沉默突变，65.1%为错义，2.4%为转录终止，1.2%为拼接剪接突变，氨基环丙烷羧酸氧化酶基因CmACO1筛选到7个独立的点突变，其中G194D果皮颜色变异明显，果实延迟成熟黄化，而果形、可溶性固形物含量和果肉颜色仍然与野生型一样。G194D自交纯合株系也呈现出果实发育期延长、果肉变硬和果实延熟，并且在2个不同试验地点表现一致，这些表型变异证明了G194D系CmACO1基因突变而来，该研究利用TILLING技术成功创造了甜瓜品质新资源，显著提高了品种货架期。Mireia González等[18]建立了甜瓜品种Piel de Sapo （Cucumis melo subsp. melo var. inodorus）的TILLING技术平台，Piel de Sapo系雄全同株、非呼吸跃变型，EMS诱变得到2 368个M2家系，用病毒侵染抗性相关的2个基因Cm-eIF4E（核细胞翻译起始因子）、eIF（iso）4E（核细胞翻译起始因子异构体）、4个与果实成熟相关的基因ACO1、Cm-NOR、Cm-DET1、Cm-DHS（脱氧羧腐胺赖氨酸合酶）以及PDS（八氢番茄红素去饱和酶）筛选突变株系，发现有4个Cm-eIF4E等位基因突变，推测其中的2个改变了蛋白质功能，PDS有2个等位突变，发生在外显子的突变改变了蛋白质功能，造成了苗期白化表型突变。4个与果实成熟相关的基因在群体中筛选突变，得到8个突变的家系。徐美红等[19]用PCR产物直接测序和克隆测序2种方法用于检测这8个突变家系的碱基变化。在直接测序中，4个突变家系的测序结果清晰，能够确认碱基的变化；其他4个家系的结果不清晰，不能确认碱基的改变。在克隆测序中，8个家系的测序结果均清晰，能够直接确定目的基因的点突变。在2种方法的比较中，克隆测序的准确率、效率明显优于直接测序法。

黄瓜方面，以色列的R. Fraenkel等[20]通过EMS诱变获得了大约1 000个M2家系，在苗期发现了诸如植株矮化、子叶自发病变、黄（花）叶、白化苗、叶片卷曲、窄型黑色子叶等诸多表型突变，利用PDS-3（八氢番茄红素去饱和酶）筛选突变株系，发现了4个突变家系，测序表明碱基突变均发生于基因内含子区域，因此并未造成相应的黄化表型突变。该套突变体库为黄瓜反向遗传学及基因功能研究奠定了很好的基础。

西瓜作物TILLING技术的应用尚未见正式报道，美国农业部蔬菜研究实验室的科学家目前正在从事相关的工作，预计将很快取得进展。

3 DNA芯片

DNA芯片是利用已知基因组序列，或来自未知序列的 cDNA 克隆制备模板 cDNA，通过人工或特定的仪器将大量模板 cDNA 按设计好的顺序定量地固定在载体上制备成高密度的微阵列。将标记好的样品 cDNA 片段（来自不同细胞、组织或整个器官）与模板上的cDNA 进行分子杂交。根据不同材料间基因差异表达的信息，推论某个基因的功能或鉴定和分离目的基因。DNA 芯片还广泛应用于基因表达谱、突变基因筛选和转基因鉴别等方面。

在西瓜上，Levi 等[4]通过与叶片cDNA消减杂交构建了西瓜果实发育不同时期（授粉后12、24、36 d）果肉消减cDNA文库。为进一步探究这些EST-unigenes在果实发育不同时期的转录表达差异，W. Patrick Wechter等[21]利用微列阵（microarray）技术对这些EST进行了差异表达分析，发现与叶片相比，有335个ESTs的表达存在明显的差异，表达量差异至少在2倍以上。其中有211个与已知功能基因同源，96个为未知基因。这些基因参与了维管系统、类胡萝卜素合成、转录调控、病原和逆境胁迫响应以及乙烯合成等，实时定量PCR也验证了这些功能基因的差异表达。

在甜瓜上，张红等[22]利用国内首个甜瓜cDNA 芯片Melon cDNA array ver1.0检测了新疆厚皮甜瓜（Cucumis melo var. ameri）果实基因表达以及经60Co射线辐射诱变后的新疆厚皮甜瓜酸味抗病变异株成熟果实基因的表达。结果显示，该芯片平均能够检测新疆厚皮甜瓜基因2 008个，检测出的基因占该芯片基因探针总数的65.4%。发现酸味抗病变异株上调表达的基因有251个，占检出基因总数的12.5%，下调表达的基因224个，占检出基因总数的11.16%。RT-PCR重复试验表明用Melon cDNA array ver 1.0检测新疆厚皮甜瓜成熟果实基因表达水平是可行的。Daniel Gonzalez-Ibeas等[23]利用抗西瓜花叶病毒甜瓜材料TGR-1551，感病材料Tendral，用DNA 芯片检测了17 443个unigenes的表达，发现接种感染后TGR-1551比对照发生了显著的转录差异，与空白对照相比，Tendral有 3 291个unigenes 差异表达，TGR-1551有2 488个unigenes 差异表达，共有677个unigene unigenes受到抑制表达。说明TGR-1551发生了广泛、深刻的转录差异。

在黄瓜上，毛伟华等[24]通过GenBank搜索已的生物代谢途径中的关键酶基因序列， 设计特异性引物， 采用RT-PCR法扩增这些酶的相应基因片段，在完成432个基因片段的克隆分离、测序和生物信息学分析工作的基础上研制出国内首张黄瓜cDNA 芯片。该芯片含有9个质控cDN段和423个cDNA探针， 涉及光反应、卡尔文循环、碳水化合物代谢、水-水循环、信号传导、激素代谢、光呼吸、防御、蛋白与氨基酸代谢等多个代谢途径。利用该芯片对黄瓜缺镁胁迫下基因表达谱进行了初步研究， 发现在缺镁胁迫下差异表达的22个基因， 其中10个基因的表达受缺镁处理抑制， 12个基因的表达受缺镁处理诱导。该芯片的研制为进一步研究黄瓜功能基因的高通量时空变化提供了有效的技术支撑。为验证该套cDNA芯片杂交结果的可靠性，毛伟华等[25]研究了黄瓜在CMV 侵染胁迫下的基因表达谱变化，并对其中5个具有代表性的基因通过实时荧光定量PCR（QRT—PCR）进行检测，共获得67个差异表达显著的基因，其中42个基因下调表达，25个基因上调表达。这些差异表达的基因涉及了许多重要代谢途径，许多与光合作用、氮同化相关的基因受到明显的抑制，而一些防御相关基因和信号传导相关基因则诱导表达。同时，也发现了一些与CMV 胁迫相关的功能未知基因或未有任何功能信息的基因。研究发现，CMV 胁迫引发了黄瓜代谢发生一系列复杂的适应性变化，PR1-1a 等基因可能在黄瓜防御CMV侵染过程发挥着重要作用。

4 RNAi技术

RNAi（RNA interference）是一种双链RNA （double-stranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing， PTGS）。RNAi技术具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低的突变体，根据表型变异可推测该基因的功能，RNAi已发展成为功能基因组学研究中基因功能鉴定的一种强有力的工具。

2012年，ANA M.等[26]利用RNAi技术沉默甜瓜 Cm-eIF4E（核细胞翻译起始因子）基因，通过对转基因T2代接种8种甜瓜易侵染的病毒，发现转基因植株对黄瓜叶脉黄化病毒（CVYV）、甜瓜坏死斑病毒（MNSV）、摩洛哥西瓜花叶病毒（MWMV）、小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）产生抗性，表明Cm-eIF4E的存在造成甜瓜对这4种病毒的易感染性。Cm-eIF4E基因对于甜瓜作物广谱高抗等位基因的发现，将是一个有效的选择途径。程鸿等[27]通过RT-PCR 方法从甜瓜中克隆得到白粉病感病相关基因CmMLO2 的cDNA 序列，RT-PCR 结果表明，CmMLO2 主要在甜瓜叶片中表达，具有组织特异性。在受到白粉病菌胁迫时CmMLO2表达显著上调，表明CmMLO2 很有可能与白粉病发病有关。构建RNAi表达载体，利用叶盘转化法转化甜瓜，获得了PCR 阳性植株，对白粉病接种鉴定结果表明，转化植株对白粉病具有抗性，证明通过ihpRNAi敲除CmMLO2，可以获得对白粉病具有抗性的甜瓜材料。

5 T-DNA插入突变

T-DNA（transferred DNA）是根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）内 Ti 质粒（tumor-inducing plasmid）上的一段 DNA， 它能侵染并稳定地整合到植物基因组中。由于插入的 T-DNA 序列已知， 插入到植物基因组中的T-DNA 类似于给基因贴了一个序列标签。通过分离T-DNA 标签位点的侧翼水稻基因组序列， 可以快捷地找到含有标签的基因， 经过插入标签基因与突变体表型的共分离检测， 从而获得基因的生物学功能。任海英等[28]采用农杆菌侵染子叶外植体的方法产生T-DNA 插入的甜瓜突变体，筛选到一个蔓枯病抗性明显增强的突变体，命名为edr2，该突变体是T-DNA 单拷贝插入甜瓜染色体引起的，edr2 的蔓枯病抗性和标记基因卡那霉素抗性基因共分离。蔓枯病菌在突变体甜瓜edr2上的侵染过程与在野生型甜瓜上相比，分生孢子萌发率降低、芽管的伸长和菌丝的生长较迟缓。蔓枯病菌的侵染能引起edr2突变体发生细胞程序性死亡，但是不引起野生型甜瓜的细胞发生程序性死亡。本研究为选育抗蔓枯病的甜瓜品种提供了新的思路，为挖掘甜瓜-蔓枯病菌互作的基因提供了支持。

6 展 望

西瓜[29]、甜瓜[30]、黄瓜 [31]全基因组测序已完成并对外公布，测序获得的大量生物信息为开展功能基因组学研究奠定了基础，也标志着瓜类作物基因组研究逐步进入到功能基因组研究时代。可以预测，未来将会有更多不同类型的cDNA文库，包括全长cDNA文库被构建，更多的EST序列将被释放，从而为基因芯片的开发提供更多的源序列。另外，TILLING 、T-DNA突变体库的构建工作也将陆续启动或完成，更多的功能基因将被鉴定和分离。功能基因组研究的深入有望鉴定和分离出控制重要农艺性状的全部基因， 揭示基因的时空表达模式，弄清在性状形成中基因与基因的互作，并在此基础上形成对基因调控网络的认识。届时人们就能够从基因结构和基因表达调控两个方面对基因进行修饰，在作物育种实践中实现分子设计育种，从而培育出抗逆性强、品质优良、有益人体健康的西瓜、甜瓜、黄瓜品种，满足人们不断增长的消费需求。

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篇4

1 rnai及rnai文库

rnai是近年来的重大发现，是动物和植物界普遍存在的一种防御反应。rnai被细胞内出现的双链rna(dsrna)所激活，可以高度特异地抑 制同源基因的表达。根据目前的研究，rnai的可能机制如下：长片段dsrna在细胞内被ⅲ型rna酶dicer切成长度大约为19～23 nt的小片段干扰 rna(small interfering rna，sirna)，由sirna参与构成复合物risc(rna-induced silence complex)。 sirna通过与同源mrna的特异配对，引 导risc特异地降解同源mrna，导致基因表达的抑制。因此小片段的sirna也可以诱导高效的基因沉默。

在线虫，注射或喂食dsrna能引起特异基因在动物各器官的沉默，而且该抑制作用可以持续到第一代的子代动物。但是在哺乳动物细胞 ，通过长片段dsrna直接转染会引起细胞的毒性反应，基因沉默效果差。近年来，陆续有用体外合成的 sirna，或用质粒、病毒等载体在细胞内 表达 sirna达到在细胞和小鼠抑制特定基因表达的报道。

rnai文库(rnai library)是人工构建的能通过诱导rnai抑制众多不同基因表达的混合文库，可以用于建立功能缺陷(loss offunction) 的生物或细胞库，进行表型的筛选。该技术在线虫的应用最为成功。在线虫等模式生物的研究中，应用rnai文库建立随机基因抑制的线虫，再 进行表型的筛选，已在其胚胎发育等领域取得了重要的发现。该文库用含方向相对的两个t7启动子的载体，可从一个随机克隆的cdna模板分别 转录出长片段的正义和反义rna，形成dsrna，在体内被dicer切割成小片段的sirna，特异地抑制靶基因的表达。由于细胞外dsrna不能在哺乳动 物细胞有效地诱导rnai，另外，长链dsrna(>30nt)可导致哺乳动物细胞的毒性反应，出现非特异的细胞生长停滞和凋亡，上述转录长片段dsrna 建立rnai文库的方法不能应用于哺乳动物及其细胞。

线虫等模式生物与人的差距较大，从模式生物获得的研究结果虽然有比较重要的意义，但不能取代在人和其他高等动物的直接研究。因 此建立可以用于人的细胞以及其他哺乳动物细胞的rnai文库有非常重要的意义。rnai文库将为研究基因功能、发现新的药物靶基因、发现疾病 相关基因、探索肿瘤治疗新途径等提供重要的方法。到目前为止，已经报道的在哺乳动物细胞建立rnai文库的方案有两类。我们将对这两类建 库方案及其在功能基因组学研究中的应用作一介绍。

2 哺乳动物细胞已知基因rnai文库

哺乳动物细胞已知基因rnai文库构建的方法如下：首先选定靶基因，根据靶基因的dna序列和sirna设计原则，合成sirna，或合成寡核 苷酸序列并克隆到表达载体，或用pcr的方法扩增为sirna表达盒。众多针对不同基因的sirna或 sirna表达载体或表达盒即构成有限的rnai文库 。应用该文库转染哺乳动物细胞可以特异地抑制不同基因的表达，通过表型的筛选来发现功能基因，如信号转导通路新分子的筛选、与肿瘤细 胞存活或转移相关基因的筛选等。

aza-blanc等应用dharmacon公司生产的针对510个基因(包括了大多数激酶基因)的sirna文库，通过转染hela细胞筛选了对trail诱导细 胞凋亡有调控作用的基因。trail是tnf家族的一员，具有抗肿瘤的功能。实验证明，trail蛋白能同dr4和dr5受体结合，诱导多种肿瘤细胞的凋 亡，而对正常细胞没有影响。aza-blanc等的筛选既发现了一些能增强trail诱导细胞凋亡的基因，也发现了一些具有抑制作用的基因。这些基因包括以前已知对trail功能有调控作用的基因如 gsk30α和srp72，也包括一些未知的调控 基因如 dobi、mirsa等，对了解trail的作用机制和抗肿瘤药物的开发有重要的意义。

berns等构建了针对7914个基因的人rnai文库。他们应用了shrna(short hairpin rna)反转录病毒载体，每一个基因构建了3个不同的 shrna载体，共有23742个不同的载体。用该 rnai文库进行基因功能的筛选，发现了1个已知、5个未知的在p53依赖的增殖阻滞中起调控作用的 基因。进一步的研究证明，抑制这些基因的表达导致细胞对p53和p19arf依赖的增殖阻滞以及对 dna破坏诱导的g1细胞周期阻滞均 不敏感。 paddison等应用shrna病毒载体，构建了针对9610个人基因和5563个小鼠基因的shrna表达文库。在26s蛋白酶系统的功能基因筛选中 ，证实该rnai文库的实用性和可靠性。

zheng等构建了一个双启动子载体pdual。该载体包含两个方向相对的聚合酶ⅲ启动子，分别为小鼠的u6启动子和人的h1启动子，中间插 入能转录sirna的dna序列(图1)。该载体的优点是，正义和反义rna从同一dna序列转录，减少了合成dna序列的长度，降低了费用和工作量。他 们巧妙地设计了能用pcr扩增的含双启动子的 sirna表达盒，并证实可以在哺乳动物细胞有效地抑制基因的表达。应用这一技术，他们构建了针 对8000个基因的sirna表达盒，在大规模的功能基因筛选中发现了一些已知和未知的在nf-kb信号转导通路中起重要作用的基因。

silva等将sirna和sirna表达载体与转染试剂混合后以微阵列的形式点在细胞培养板上，可以转染在板上生长并与之接触的活细胞。该 技术为应用rnai文库进行细胞的基因功能筛选提供了一个简单有效的方法。

上述研究均证明了有限的已知基因rnai文库在哺乳动物细胞基因功能研究中的可行性，为哺乳动物及其细胞大规模功能基因组学的研究 提供了一个重要的技术。

已知基因rnai文库存在以下缺陷：a．不是随机rnai文库，必须知道靶基因的序列，细胞基因的覆盖面窄；b．针对每一个基因必须合成 2条以上寡核苷酸，才能确保从中选出干扰效果较好的；c．需要合成众多的不同sirna，或构建众多的不同载体；d．所需费用高，筛选的工作 量巨大。 

3 晡乳动物细胞随机rnai文库 

随机rnai文库(random rnai library)是人工构建的可能针对任何基因的rnai文库。目前已报道的方法有两种，一是通过化学合成随机 dna序列的方法，二是通过cdna酶切并克隆到载体的方法。随机rnai文库不需要知道靶基因的序列，因此理论上讲可以构成抑制任何基因表达的 干扰文库，克服已知基因rnai文库细胞基因覆盖面窄的缺陷。该文库同常用的基因表达文库一样，为不同 sirna载体的混合物，因此易于保存 ，显著地减少了筛选的工作量。 

化学合成随机dna序列构成随机rnai文库的方法是应用以下原理。在化学合成寡核苷酸时，如果碱基选为n，则dna合成仪在合成dna片段 时将随机选择a、t、g、c中的任何一种。19～21 nt的寡核苷酸如果部分或全部选为n时，则形成了众多不同随机序列寡核苷酸的混合物。在进 行互补链合成并克隆到双启动子rnai载体(见图1的载体)后，就形成了随机rnai文库。 

限制性内切酶mme i的特点是在dna识别序列(tccgac)下游20～21 bp处切开dna片段。 luo等巧妙地应用mme i的独特特性，设计了将长 cdna片段酶切为20～2l nt小dna片段，克隆于sirna表达载体构成随机rnai文库的方案，称为speed。首先将随机cdna片段与含mme i酶切位点发 夹结构的dna接头(linker)连接，再用 mme i消化，获得20～21 bp与接头连接的cdna小片段。将形成的双链dna打开成单链，合成互补链，形成 方向相对的两个小片段cdna的拷贝，中间为不配对的形成发夹结构的dna序列。再克隆到反转录病毒载体中，构成随机rnai文库。利用小鼠胚胎 cdna文库，他们建立了含3×106克隆、可以抑制众多不同基因的随机rnai文库，证明该方法的可行性。 

shirane等应用同luo等基本相同的思路独立地设计了构建随机rnai文库的方法，称为 epril。应用鼠源fl5.12细胞的cdna文库，他们建 立了随机rnai文库。对240个不同克隆的随机测序发现，215个克隆含有正确的能表达sirna的 dna片段。blast分析显示，165个克隆的插入片段 与己知基因或est的顺序相吻合，绝大多数分属不同的基因。这一结果说明，epril可以用于复杂基因的随机rnai文库的构建。 

篇5

【关键词】宏基因组学；微生物群落；遗传物质；口腔

【中图分类号】Q781

【文献标志码】A

宏基因组学认为，生命研究的对象应是生物环境中全部微小生物的基因组，即特定环境下所有生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和不可培养的微生物的基因总和，微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌；因此，宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物群落研究方法，也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。

利用宏基因组学技术研究口腔微生物，无需单一分离培养某一种类的微生物，即可直接在基因水平上研究口腔微生物，包括可培养和不可培养微生物。宏基因组学应用于口腔微生物的研究，主要包括两个方面：一方面进行微生物生态学研究，从整体微生物群落水平来研究口腔微生物，揭示口腔微生物群落多样性及其变化；另一方面是进行口腔微生物及其基因的研究，从中筛选到新的功能基因及其产物。通过这两方面的研究，较全面地了解口腔微生物的群落结构和功能基因组，为深入探索口腔微生物的代谢活动，最大限度地发掘口腔微生物资源提供可能。

1　宏基因组学的研究方法

宏基因组学是从特定环境中直接分离所有微生物的DNA，选择合适的载体用于克隆DN段，将DN段克隆到宿主细胞中进行表达，根据某些生物活或基因序列筛选有价值的克隆并进行其功能分析。

1.1宏基因组文库的构建

1.1.1环境微生物DNA的提取　环境样品DNA的提取是基因组文库构建中最重要的一步，不仅要尽可能地将环境中所有微生物的DNA提取出来，而且还要保证一定的DN段长度和完整性。根据提取样品总DNA前是否需要分离细胞，可将其提取方法分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法可直接破碎样品中的微生物细胞而使其DNA得以释放。原位裂解法无需对样品微生物进行复苏，黏附颗粒上的微生物细胞亦能被裂解，所得DNA能更好地代表微生物的多样性。由于原位裂解法所提取的DN段仅为1～50kb，故其通常用于构建小片段插入文库（以质粒或入噬菌体为载体）的DNA提取。异位裂解法则先采用物理方法将微生物从样品中分离出来，然后以较温和的方法抽提其DNA。此法提取可以获得长度为20～500kb的大片段DNA，而且纯度高，但却容易丢失微生物物种信息。该方法适用于构建大片段插入文库（以黏粒或细菌人工载体为载体）的DNA提取。

1.1.2载体选择　目的基因能否有效地转入宿主细胞并在其中高表达，在很大程度上取决于载体。通常用于DNA克隆的载体包括质粒、黏粒和细菌人工染色体（bacterial　artificial　chromosome，BAC）等。质粒一般用于克隆小于10kb的DN段，适用于单基因的克隆与表达。黏粒又称柯斯质粒或柯斯载体，用于克隆大片段的DNA分子，其克隆外源DN段的极限高达350kb，远远超过质粒载体的克隆能力。BAC用于克隆150kb左右大小的DN段，最多可保存300kb个碱基对，转化率高，而且其以环状结构存在于细菌体内，易于分辨和分离纯化。另外，构建能容纳40kb外源DNA插入片段的fosmid文库也有报道。

1.1.3宿主选择　目前，常用的宿主主要有大肠埃希菌以及链霉菌属或假单胞菌属。一些缺陷型突变体细菌也可以作为宿主进行宏基因组文库的功能筛选。宿主的选择主要应考虑其转化率和宏基因表达以及重组载体在宿主细胞中的稳定性和目标性状的筛选等。对于任何宏基因组来源的基因来说，大肠埃希菌依然是最理想的克隆和表达宿主。也可以用其他宿主菌，例如被用来鉴定与新抗生素生物合成相关基因的浅青紫链霉菌和一些革兰阴性细菌。也可以用穿梭黏粒或BAC载体将构建于大肠埃希菌的文库转入其他宿主，如链霉菌属或假单胞菌属中。根据不同微生物产生活性物质的差异和研究目标的不同，选择不同的宿主。随着技术的成熟和新宿主的选择，基因筛选率和功能基因检测率得以提高，进而宏基因组文库的目标基因的表达也得以提高。

1.2宏基因组文库的筛选

根据研究目的，宏基因组文库的筛选通常有功能筛选和序列筛选两种方法。功能筛选最常用方法是根据重组克隆产生一些酶蛋白功能活性，采用各种检测手段，挑选活性克隆子，得到完整的功能基因和带有目的基因的基因簇，发现全新的基因或活性物质。功能筛选首先要求功能基因或带有目的的基因簇在宿主中表达，但因其受到检测手段的限制，往往是在数千个甚至数百万个重组克隆子中才能检测到有用的活性克隆。序列筛选是依赖于目的基因的保守DNA序列，以序列相似性为基础，执行某类功能的酶可能具有相似的基因序列，根据已有的序列信息设计引物，进行PCR扩增或杂交筛选阳性克隆子。序列筛选一般只能获得结构基因的片段，而不能获得完整的功能基因；但是，它可以将扩增产物进行标志并将其作为探针筛选宏基因文库，以获得完整的功能基因。用这种方法有可能筛选到某一类结构或功能的蛋白质中的新分子。

宏基因组文库的筛选除了功能筛选和序列筛选法外，还可以采用底物诱导基因表达法（sub-strate-induced　gene　expression，SIGEX）。SIGEX是以代谢相关基因或酶基因往往有底物存在的条件下才表达，反之则不表达的原理来筛选目的代谢基因的。SIGEX的优点在于它为高通量筛选提供了保障，而且不需要对底物进行修饰。

2　宏基因组学在口腔微生物研究领域中的应用

2.1口腔微生物群落结构分析

口腔是一个由大量微生物组成的复杂的生态系统，人类口腔中寄居着大约700多种细菌。人类口腔适宜的温度、湿度，丰富的营养来源，结构的复杂性和理化性质的不同，为口腔内各种微生物的生长、繁殖和定居提供了非常适宜的环境，因而也就造就了口腔微生物群的多样性。口腔微生物大部分可以相互关联并形成生物膜，抵抗机械清除力或抗生素治疗，但是在环境变化或其他口腔情况（如个人口腔卫生质量）变化触发时，它们也可成为致病微生物。

菌斑指示剂和传统培养方法以及常规的PCR特异性扩增的分子生物学方法在某种程度上都不能完整地反映整个微生物群落的组成和动态变化，不适合用其研究复杂的口腔微生物群落。此外，在难培养或不可培养的微生物当中，可能也有致病菌匿藏其中，因而也不能有效地用其研究与病程相关的微生物。

随着分子生物学和分子遗传学技术的发展，在基因组学的基础上诞生了宏基因组学这一门崭新的交叉学科。宏基因组学是继发明显微镜以来研究微生物最重要的进展，将为微生物世界带来革命性的突破。Turnbaugh等利用16S　rRNA基因测序发现：胖人和瘦人的内脏中有着不同的微生物菌群；当胖人减肥的时候，他们内脏中的细菌群基因也同样发生变化，更加接近瘦人内脏中的细菌群。

基于常规的口腔细菌培养方法和细胞学显微镜检查，目前公认变异链球菌和乳酸杆菌等是引起龋病的主要致病菌；但是，随着宏基因组学在微生物的种类和多样性研究中的应用，有关龋病是由单一细菌引起或是由生物膜中的多种细菌引起的定论面临质疑。目前普遍认为，龋病并不是仅由变异链球菌或其他任何一种菌斑中的细菌单独引起的，而是由各种产酸菌相互作用的结果。

Aas等在对51名龋患者的1285个菌斑细菌的16S　rRNA序列进行分析后发现，50％的细菌不能识别，一些新的细菌菌种与龋病的发生有关。Keijser等在用焦磷酸测序法分析健康人涎液和牙菌斑中细菌群时发现，口腔微生物具有多样性。即他们从98名健康成人口腔中取得的牙菌斑就由1万个微生物表型组成，其种族数远远超过之前报道的通过培养或者传统克隆和测序技术定义的700种口腔微生物表型。

Zaura等在利用焦磷酸测序技术检测了3名健康高加索人口腔内5个部位的微生物组后发现，在健康人的口腔中微生物有3600种独特物序列，超过500种不同的分类单元或“物种级”表型和88～104种高级分类群，每个单独的样品平均藏匿有266种分类单元。从这3名个体微生物组的测序结果分析可知，高级分类群、分类单元和独特序列都有一个较大的重叠，即84％的高级分类群、75％的分类单元和65％的独特序列至少在这3个微生物组中的2个组中存在。这3名个体的总共6315个独特序列中有1660个相同序列，这1660个相同序列，即“核心微生物组”贡献了66％的测序内容，重叠的分类单元贡献了94％的内容，而几乎所有的内容（99.8％）都属于共享的高级分类群。

研究证实，在不同的健康人的口腔微生物中，大部分微生物组是相同的，提示可能存在健康口腔核心微生物组。Kanasi等在对80名患龋和无龋婴幼儿牙菌斑微生物的16S　rRNA序列克隆分析中发现，两者之间存在着139种不同微生物。Gross等通过酶促法测序技术对无龋和患龋年轻恒牙牙菌斑微生物的16S　rRNA序列进行分析后认为，龋齿中产酸菌除了变异链球菌和乳酸杆菌外，月形单胞菌、奈瑟菌和缓症链球菌同样是潜在的产酸细菌。Willner等等在利用高通量测序技术检测了19名健康人口腔咽部的病毒宏基因组序列后发现，口腔咽部是一个潜在的被噬菌体T3侵蚀的肠道菌储存库。另外，他们还发现了编码血小板凝集因子PblA和PblB的两个寄生于变异链球菌中的噬菌体sm-1基因，而之前有研究称在心内膜上发现了变异链球菌。这说明，口腔中的病毒与心脏疾病存在潜在的联系。

宏基因组学技术可以避开传统的培养方法，在DNA水平来探讨口腔微生物群落结构及其与环境微生物的关系。微生物多样性在基因水平上主要表现为基因组大小和基因数目的多样性，遗传物质化学组成的多样性和某些特异性序列的差异。宏基因组技术为研究口腔微生物复杂群落和多样性提供了重要的技术手段，通过快速可靠地获得口腔微生物中各种微生物的菌落指纹和特征性核苷酸序列，以系统分析口腔微生物的多样性及其分类地位，发掘丰富的口腔微生物资源。

2.2口腔微生物宏基因组文库中的新型基因筛选及其功能

宏基因组学除了研究微生物群落结构及其功能外，还可用于发现新的基因和开发新的微生物活性物质。Jiang等构建土壤宏基因文库，成功地克隆和鉴定出一种新型的β-葡萄糖苷酶基因，该基因包含一个由151个氨基酸编码组成的多肽。该研究对深入挖掘土壤未培养微生物的β-葡萄糖苷酶基因资源和该基因功能具有的重要意义。陈春岚等从富集培养物宏基因组文库中筛选出一个表达木聚糖酶基因umxyn10B，该基因大小为999bp，编码产物的氨基酸序列具有较好的同源性。对其功能进行研究发现，该酶具有优良的理化特性，可广泛应用于食品、能源、造纸和纺织等行业。Yu等利用宏基因功能筛选发现的两个新型低温活性酶脂EstM-N1和EstM-N2，属于细菌脂肪分解酶Ⅷ家族成员。这一发现将推动生物催化剂的应用。

当前，宏基因组学技术已经在微生物学研究的诸多领域，尤其是在发现具有潜在应用价值的次生代谢产物方面显示出了无穷的魅力，但是，利用宏基因组技术探索口腔微生物的新的功能基因尚处于起步阶段。Warburton等对口腔细菌群体中的耐药基因进行了分析，结果发现一个新的耐四环素基因tet32能够使四环素失活。虽然对口腔微生物新的功能基因及其功能研究还太少，但依然可以借助宏基因组学技术发掘新基因，以利用这些新基因在口腔医学行业发挥应有的作用。